基因工程
一、基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的额，因此又叫做DNA重组技术。 基因工程的别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 基因拼接技术或DNA重组技术 生物体外 基因 DNA分子水平 剪切→ 拼接→ 导入→ 表达 实质（原理） 基因重组 克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传特性 结果改造的方向
二、基因工程的基本工具
1、限制性核酸内切酶-----“分子手术刀” 2、DNA连接酶-----“分子缝合针”
3、基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车” 1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶
（限制酶） （1）存在：主要存在于原核生物中。 （2）特性：特异性，一种限制酶只能
识别一种特定的核苷酸序列，并且能在
特定的切点上切割DNA分子。
（3）切割部位：磷酸二酯键
（4）作用：能够识别双链DNA分子的
并且使每一条链 某种特定核苷酸序列，
中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸
二酯键断开。
（5）识别序列的特点：
6）（切割后末端的种类：DNA分子经限
制酶切割产生的DNA片段末端通常有两
种形式——黏性末端和平末端。当限制酶 在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两
条链分别切开时，产生的是黏性末端，而
当限制酶在它识别序列的中轴线处切开
时，产生的则是平末端。
种类 来源 功能特性 2．“分子缝合针”——DNA连接酶
（1）作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。 （2）类型 4 4
相同点：都连接磷酸二酯键
3．“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件：
①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
(2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
(3)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。 (4)载体的作用:
①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 【解题技巧】
(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。
(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 (4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。
(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。
(7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的
E·coliDNA连接酶 大肠杆菌 TDNA连接酶 T噬菌体 只能将双链DNA片段互补缝合两种末端，但的黏性末端之间的磷酸二连接平末端之间的酯键连接起来 效率较低 基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。 (8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。
例1．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是－C↓AATTG－和－G↓AATTC－。如图表示四种质粒和目的基因，其中，箭头所指部位为限制酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是（ ）
A
限制酶的应用特点
（1）在获取目的基因和切割载体时通常用同种限制酶，以获得相同的黏性末端。但是如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。 （2）为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接，可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体，使目的基因两侧及载体上具有两个不同的黏性末端 五种酶的比较 限制性内切酶 作用底物 DNA分子 作用部位 磷酸二酯键 形成产物 黏性末端或平末端 重组DNA分子 DNA连接酶 DNA片段 磷酸二酯键 DNA聚合酶 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 子代DNA DNA解旋酶 DNA分子 碱基对间的氢键 脱氧核苷酸单链 RNA聚合酶 核糖核苷酸 磷酸二酯键 核糖核苷酸单链 三、基因工程的操作步骤 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定
1、目的基因的获取 获取目的基因的方法： （1）直接分离法
从基因文库中获取目的基因
将含有某种生物不同基因的许多DNA短片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。包括基因组文库和cDNA文库。 直接从基因组中获取目的基因最常用的方法是： “鸟枪法”。 （2）人工合成法
化学合成法：片段较小，核苷酸序列已知的目的基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。
反转录法：以RNA为模板，在逆转录酶作用下合成目的基因DNA（cDNA）。
（4）利用PCR技术扩增目的基因 PCR技术：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。由于PCR过程在高温下进行，因此需要使用热稳定的DNA聚合酶。
目的：通过指数式扩增获取大量的目的基因
前提：要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。 2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
(3)基因表达载体的构建过程： 3．将目的基
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