农杆菌介导的植物转基因技术
一、实验目的
1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。
2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。
二、实验原理
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
实验一 培养基配制
一、仪器和试剂
1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台
2、药品：Beef extract (牛肉浸膏) 5g/L ，Yeast extract (酵母提取物) 1g/L ，Peptone (蛋白胨) 5g/L ，Sucrose (蔗糖) 5g/L ， 100ml ，Agar (琼脂) 100ml， MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙酸），6-BA（6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif），链霉素（str）。
二、实验方法
第一组配制YEB固体培养基
1、配制250mlYEB固体培养基：先称取 Beef extract (牛肉浸膏)； Peptone (蛋白胨)； Yeast extract (酵母提取物)； Sucrose (蔗糖)；1g ；琼脂粉；将上述药品
置于250ml三角瓶中，用量筒称取200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml，用NaOH调pH=。
2、灭菌：将盛有250ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。
3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60℃时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100μg/mlkan+50μg/ml Str+50μg/ml rif），以免温度过高导致抗生素失效。
4、倒板：将抗生素与培养基混匀，每个平皿倒15ml培养基，可以倒16个平皿，倒完后打开平皿盖，在紫外灯下照10min，等待培养基凝固，盖上平皿盖，封口备用。
第二组配制YEB液体培养基
1、配制500mlYEB液体培养基：先称取 Beef extract (牛肉浸膏)； Peptone (蛋白胨)； Yeast extract (酵母提取物)； Sucrose (蔗糖)；2g ；将上述药品置于500ml三角瓶中，用量筒称取450ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至500ml，用NaOH调pH=。
2、灭菌：将盛有500ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。
3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60℃时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100μg/mlkan+50μg/ml Str+50μg/ml rif），以免温度过高导致抗生素失效。
4、分装：将培养基分别分装到试管和三角瓶中，每个试管中分装5ml，分装12个试管。每个三角瓶中倒入35ml，共12个三角瓶。
5、分装好后，封口备用。
第三组配制MS液体培养基
1、配制500mlMS液体培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后混匀定容至500ml，用NaOH调pH=。
2、灭菌：将盛有500ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。
3、乙酰丁香酮的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60℃时（手可触摸）加入已经过滤好的乙酰丁香酮。
4、分装：将培养基分别分装到三角瓶中，每个三角瓶中倒入40ml，共12个三角瓶。
5、分装好后，封口备用。
第四组配制MS共培养基
1、配制500mlMS固体共培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后加入激素NAA和6-BA（按照实际需要，根据母液浓度计算用量），混匀定容至500ml，用NaOH调pH=，然后再加入7%的琼脂粉。
2、灭菌：将盛有500ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。
3、分装：将培养基分别分装到平皿中，每个平皿中倒入25ml，共20个平皿。 4、分装好后，封口备用。
第五组配制MS分化筛选培养基
1、配制1000mlMS固体共培养基：用2个500ml三角瓶进行盛取，先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后加入激素NAA和6-BA（按照实际需要，根据母液浓度计算用量），混匀定容至500ml，用NaOH调pH=，然后再加入7%的琼脂粉。
2、灭菌：将盛有500ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。
3、分装：将培养基分别分装到平皿中，每个平皿中倒入25ml，共40个平皿。 4、分装好后，封口备用。
第六组配制MS生根培养基
1、配制500mlMS固体共培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后加入激素NAA和6-BA（根据母液浓度计算用量），混匀定容至500ml，用NaOH调pH=，然后再加入7%的琼脂粉。 2、灭菌：将盛有500ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。
3、分装：将培养基分别分装到100ml三角瓶中，每个三角瓶中倒入35ml，共14个三角瓶。
4、分装好后，封口备用。
实验二 植物转化工程菌的制备
一、仪器和试剂
1 仪器：低温离心机（德国EPPENDORF公司）；恒温培养箱（哈东联）；超净工
作台（苏州净化），恒温摇床。
2 试剂：根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens.)菌种EHA105，YEB培养基， 接种环，牙签。
二、实验方法
1、将农杆菌接种于附加50mg/L 卡那霉素、50mg/L 链霉素、50mg/L 利福平的YEB固体培养基上，28℃暗培养48h，至长出单菌落。
2、用接菌环挑取单菌落，接种在含相应抗生素的YEB液体培养基中，于28℃，180rpm，培养过夜。
3、待菌液长至OD600为 ~ 时，将其按1∶10的比例接种到新鲜的上述培养基中振荡培养，进行二次活化。
实验三 农杆菌侵染转化
一、仪器和试剂
1 仪器：超净工作台（苏州净化），植物组织培养箱。
2 试剂：根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens.)菌种EHA105，红花无菌苗， MS
液体培养基，共培养基（MS+6-BA+NAA），手术刀，镊子，剪刀，滤纸，培养皿。
二、实验方法
1、当农杆菌OD600为 ~ 时，吸取菌液于无菌50ml离心管中，2000 rpm，离心10min，弃上清，收集菌体，用等体积的MS液体培养基将菌体重悬，备用。
2、侵染 取红花无菌苗，在超净工作台中将子叶上下边缘切掉，置于无菌培养皿内，加入适量重悬好的菌液，侵染8~25 min（第一组侵染8min，第二组侵染10min，第三组侵染12min，第四组侵染15min，第五组侵染20min，第六组侵染25min），此间要不时的摇动。
3、除菌 侵染完成后，弃去菌液，用无菌滤纸吸干多余的菌液。 4、共培养 侵染过的红花子叶接种于共培养培养基上，28℃暗培养3d，观察是否有农杆菌过量生长。
实验四 农杆菌侵染转化
一、仪器和试剂
1 仪器：超净工作台（苏州净化），植物组织培养箱。
2 试剂：根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens.)菌种EHA105，红花无菌苗，无
菌水，分化培养基（MS+6-BA），滤纸，镊子，培养皿。
二、实验方法
1、除菌 取共培养后染菌的植物材料，放于无菌三角瓶内，先用无菌水（可以添加抗生素）冲洗至溶液澄清为止。（如果没有农杆菌滋生的，此步骤可省略）
2、分化培养 将除菌后的植物材料转至分化筛选培养基中进行转化筛选，诱导再生植株，每天观察，记录分化情况，以后每两周继代一次。
农杆菌介导的植物转基因技术实验指导
