黄芩苷对海人酸致痫小鼠海马神经细胞凋亡的影响

黄芩苷对海人酸致痫小鼠海马神经细胞凋亡的影响

欧阳龙强* 杨少春* 邹连生* 梁日生△ 刘德华* 高志强* 程伟*

【摘 要】【摘要】目的 探讨黄芩苷对海人酸诱导的小鼠癫痫持续状态后海马神经细胞凋亡的影响。方法54只ICR雄性小鼠随机分为对照组、癫痫持续状态(SE)组、黄芩苷治疗组（100mg/kg）。采用腹腔内注入海人酸（12mg/kg）建立小鼠癫痫持续状态模型。通过TUNEL染色观察小鼠海马CA1、CA3区神经细胞的凋亡程度；免疫组化观察海马组织中caspase-3细胞的阳性表达情况；RT-PCR检测海马组织中Bax、Bcl-2mRNA的含量；Western blot检测Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白的表达量。结果与癫痫持续状态组相比，黄芩苷可显著减轻癫痫持续状态后海马神经细胞的凋亡(CA1区:0.3984±0.0586 vs.0.7258±0.0235,P＜0.05;CA3区:0.3593±0.0391 vs. 0.6191±0.0686,P＜0.05)，降低海马中BaxmRNA的合成和Bax、caspase-3蛋白的表达(P＜0.05)，增加Bcl-2mRNA及蛋白的表达(P＜0.05)。结论黄芩苷能够减轻小鼠癫痫持续状态后海马神经细胞的凋亡，其作用机制可能通过上调Bcl-2的表达和下调Bax、caspase-3的表达来发挥抗凋亡作用。 【期刊名称】中国神经精神疾病杂志 【年(卷),期】2014(040)005 【总页数】6

【关键词】【关键词】癫痫 黄芩苷 海人酸 凋亡

癫痫(epilepsy，EP)是一组由大脑神经元异常放电引起短暂性中枢神经系统功能失常为特征的慢性脑部疾病。海马是中枢神经系统内对癫痫最敏感的脑区之一，癫痫发作可引起海马特定区域（CA1区、CA3区、齿状回、梨状皮质区等，

尤以CA1区、CA3区最甚）神经细胞凋亡或坏死[1]。有研究[2]显示，癫痫发作所引起的脑损伤主要由神经元凋亡主导，有效控制神经元的凋亡能减少癫痫发作所引起的神经元损伤。黄芩苷（Baicalin）是中药黄芩中提取的单体化合物，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗肿瘤等功能[3]，我们前期研究发现，黄芩苷对小鼠癫痫后海马神经细胞具有抗凋亡作用[4]，但其具体机制尚不清楚。本研究采用海人酸（kainic acid,KA)建立癫痫模型，进一步探讨黄芩苷对小鼠癫痫持续状态后海马神经细胞凋亡的影响及其作用机理。

1 材料与方法

1.1 研究对象 由上海斯莱克实验动物中心提供的ICR健康雄性小鼠54只[许可证号：SCXK(沪) 2007-0005]，体质量23～28g。随机分对照组、癫痫持续状态（SE）组和黄芩苷治疗组，每组18只。主要药品、试剂与仪器：黄芩苷购自美国sigma公司;海人酸购自美国BIOMOL公司;RT-PCR试剂盒购自美国Promega公司；兔抗鼠Bax、Bcl-2多克隆抗体购自santa Cruz公司；兔抗鼠caspase-3多克隆抗体购自santa Cruz公司；兔超敏二步法免疫组化检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2 制模与给药 采用腹腔内注入KA（12mg/kg）建立小鼠癫痫持续状态模型。按Racines[5]分级标准评价癫痫行为：0级，正常行为；I级，面部肌肉痉挛表现为咀嚼运动、眨眼、动须等，湿狗样颤动；Ⅱ级，颈部肌肉痉挛表现为点头运动；Ⅲ级，一侧前肢阵挛；Ⅳ级，站立伴双前肢阵挛；V级，在Ⅳ级的基础上身体向后倒下失去平衡，四肢抽动。达到Ⅲ级改变以上者定为癫痫发作，连续的痫性发作超过30 min以上者为SE。制模过程中因癫痫持续状态死亡3只，

制模成功率约75%，制模不成功者予以剔除，不足预定数额者按照随机抽样原则补齐动物并重新制备模型。制模成功后，黄芩苷治疗组以100mg/kg的剂量腹腔注射黄芩苷1次，12h后重复注射1次（黄芩苷生物半衰期较短，本实验采取2次给药法，结合既往的研究结果，黄芩苷100mg/kg为最适药物浓度[6]）。SE组和对照组注入等量的生理盐水。ICR小鼠每组6只，10%水合氯醛腹腔麻醉后，用生理盐水与4%多聚甲醛心脏灌注取脑，4%多聚甲醛浸泡过夜，前囟后1.8～3.0mm处脑冠状切面行石蜡切片，用于TUNEL染色和免疫组化；每组另取12只ICR小鼠，麻醉后断头取双侧海马，提取总蛋白与RNA，分别用于Western blot与RT-PCR。

1.3 TUNEL法检测神经元凋亡 按TUNEL试剂盒说明书进行染色与检测。光镜下观察海马CA1、CA3区棕褐色TUNEL阳性细胞，并计数连续3张切片整个CA1、CA3区TUNEL阳性细胞数，在400倍视野计算平均阳性细胞百分数。 1.4 免疫组化检测caspase-3的分布 石蜡切片常规脱蜡脱水。按照说明书采用SP法进行染色。以PBS代替一抗作阴性对照。caspase-3一抗浓度为1：100。DAB显色，苏木素复染，盐酸分化，氨水返蓝。光学显微镜观察、拍片。 1.5 RT-PCR检测Bcl-2和BaxmRNA Bcl-2引物序列(240bp)：5'-CTC GTC GCT ACC GTC GTG ACT TCG-3'(上游)，5'-CAG ATG CCC GTT CAG GTA CTCAGTC-3'(下游)。Bax引物序列(360bp)：5′-AAG CTG AGCGAG TGTCTCCGGCG′(上游)，5′-GCC ACA AAG ATG GTC ACT GTC TGCC-3′(下游)。内参β-actin引物序列(198bp)：5′ATC GTG CGT GAC ATC AAA GAGA3′(上游)，5′TGC CAC AGG ATTCCA TACCCAA3′(下游)。用Trizol提取海马组织总RNA。逆转录合成cDNA第一链，操作步骤根据RT-PCR试剂盒