高中生物选修一生物技术实践知识点总结

使用顺序 先生长素， 后细胞分裂素 先细胞分裂素， 后生长素 同时使用

实验结果 有利于分裂但不分化 生长素／ 细胞分裂素比值与结果

促根分化， 比值高时 抑芽形成 +

比值低时 比值适中 促芽分化， 抑根形成 促进愈伤组织生长 细胞既分裂也分化 分化频率提高 环境条件：PH、温度、光等环境条件。

不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将pH控制在5.8左右，温度控制在18~22℃，并且每日用日光灯照射12h. 4、操作流程

配制MS固体培养基：配制各种母液：将各种成分按配方比例配制成的浓缩液（培养基母液）。 ·使用时根据母液的浓缩倍数，计算用量，并加蒸馏水稀释。

·配制培养基：应加入的物质有琼脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，并用蒸馏水定容到1000毫升。

·在菊花组织培养中，可以不添加植物激素

原因是菊花茎段组织培养比较容易。·灭菌：采取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。

·MS培养基中各种营养物质的作用是什么？与肉汤培养基相比，MS培养基有哪些特点？ 大量元素和微量元素提供植物细胞所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，维持细胞渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。 微生物培养基以有机营养为主，MS培养基则需提供大量无机营养。

外植体的消毒 外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段。选取菊花茎段时，要取生长旺盛的嫩枝。菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右。用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70%的酒精中摇动2~3次，持续6~7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗。取出后仍用无菌吸水纸吸干外植体表面水分，放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中1~2min。取出后，在无菌水中至少清洗3次，漂洗消毒液。 注意：对外植体进行表面消毒时，就要考虑药剂的消毒效果，又要考虑植物的耐受能力。 接种：接种过程中插入外植体时形态学上端朝上，每个锥形瓶接种7～8个外植体。外植体接种与细菌接种相似，操作步骤相同，而且都要求无菌操作。

培养：应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒，保持适宜的温度（18~22℃）和光照（12h） 移栽：栽前应先打开培养瓶的封口膜，让其在培养间生长几日，然后用流水清洗根部培养基。然后将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间，进行壮苗。最后进行露天栽培。 栽培

外植体在培养过程中可能会被污染，原因有外植体消毒不彻底；培养基灭菌不彻底；接种中被杂菌污染；锥形瓶密封性差等。

专题二 月季的花药培养

被子植物的花粉发育被子植物的雄蕊通常包含花丝、花药两部分。花药为囊状结构，内部含有

许多花粉。花粉是由花粉母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。被子植物花粉的发育要经历小孢子四分体时期、单核期和双核期等阶段。在小孢子四分体时期，4个单倍体细胞连在一起，进入单核期时，四分体的4个单倍体细胞彼此分离，形成4个具有单细胞核的花粉粒。这时的细胞含浓厚的原生质，核位于细胞的中央（单核居中期）。随着细胞不断长大，细胞核由中央移向细胞一侧（单核靠边期），并分裂成1个生殖细胞核和1个花粉管细胞核，进而形成两个细胞，一个是生殖细胞，一个是营养细胞。生殖细胞将在分裂一次，形成两个精子。 注意：①成熟的花粉粒有两类，一类是二核花粉粒，其花粉粒中只含花粉管细胞核和生殖细胞核，二核花粉粒的精子是在花粉管中形成的；另一类是三核花粉粒，花粉在成熟前，生殖细胞就进行一次有丝分裂，形成两个精子，此花粉粒中含有两个精子核和一个花粉管核（营养核）②花粉发育过程中的四分体和动物细胞减数分裂的四分体不同。花粉发育过程中的四分体是花粉母细胞经减数分裂形成的4个连在一起的单倍体细胞；而动物细胞减数分裂过程中的四分体是联会配对后的一对同源染色体，由于含有四条染色单体而称为四分体。③同一生殖细胞形成的两个精子，其基因组成完全相同。

产生花粉植株的两种途径通过花药培养产生花粉植株（即单倍体植株）一般有两种途径，一种

是花粉通过胚状体阶段发育为植物，另一种是花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再将其诱导分化成植株。这两种途径之间并没有绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。 注意：①无论哪种产生方式，都要先诱导生芽，再诱导生根②胚状体：植物体细胞组织培养过程中，诱导产生的形态与受精卵发育成的胚非常类似的结构，其发育也与受精卵发育成的胚类似，有胚芽、胚根、胚轴等完整结构，就像一粒种子，又称为细胞胚。

影响花药培养的因素诱导花粉能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素影响，其中材料的选

择与培养基的组成是主要的影响因素

·亲本的生理状况：花粉早期是的花药比后期的更容易产生花粉植株，选择月季的初花期。 ·合适的花粉发育时期：一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高

·花蕾：选择完全未开放的花蕾

·亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等对诱导成功率都有一定影响

·材料的选取：选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。确定花粉发育时期的最常用的方法是醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色 ·材料的消毒

·接种和培养：灭菌后的花蕾，要在无菌条件下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。在剥离花药时，要尽量不损伤花药（否则接种后容易从受伤部位长生愈伤组织），同时还要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成，通常每瓶接种花药7～10个,培养温度控制在25℃左右,不需要光照.幼小植株形成后才需要光照.一般经过20～30天培养后,会发现花药开裂,长出愈伤组织或形成胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。还需要对培养出来

的植株做进一步的鉴定和筛选。

植物组织培养技术与花药培养技术的相同之处是：培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。两者的不同之处在于：花药培养的选材非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾；花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基；花药培养对培养基配方的要求更为严格。这些都使花药培养的难度大为增加。

专题五 ＤＮＡ和蛋白质技术 课题一 ＤＮＡ的粗提取与鉴定

·提取DNA的溶解性原理包括哪些方面？

DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精。

·DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？要使DNA溶解，需要使用什么浓度？要使DNA析出，又需要使用什么浓度？

在0.14mol/L时溶解度最小；较高浓度可使DNA溶解；0.14mol/L可使DNA析出。

·在溶解细胞中的DNA时，人们通常选用2mol/LNaCl溶液；将DNA分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中缓慢注入蒸馏水，以稀释NaCl溶液。酒精是一种常用有机溶剂，但DNA却不能溶于酒精（特别是95％冷却酒精），但细胞中蛋白质可溶于酒精。

从理论上分析，预冷的乙醇溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。 ·采用DNA不溶于酒精的原理，可以达到什么目的？

将DNA和蛋白质进一步分离。

·提取DNA还可以利用DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。利用该原理时，应选用怎样的酶和怎样的温度值？

蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对DNA产生影响。温度值为60～80℃，因为该温度值蛋白质变性沉淀，而DNA不会变性。

补充：DNA的变性是指DNA分子在高温下解螺旋，其温度在80℃以上，如在PCR技术中DNA变性温度在95℃。

·洗涤剂在提取DNA中有何作用？

洗涤剂将细胞膜上的蛋白质，从而瓦解细胞膜。

·当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用什么指示剂进行鉴定？

在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色。

原理总结：通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以从细胞中提取和提纯DNA；再利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA。 实验材料的选取

不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。

本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。

鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。 破碎细胞，获取含DNA的滤液

·若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获取含DNA的滤液？

在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；切碎洋葱，加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。 ·为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？

答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。 ·在以上实验中，加入蒸馏水、洗涤剂和食盐的作用分别是什么？过滤时应当选用（滤纸、尼龙布）。血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂；洗涤剂瓦解细胞膜；食盐溶解DNA物质；选用尼龙布进行过滤。

·在处理植物组织时需要进行研磨，其目的是什么？研磨不充分产生什么结果？

破碎细胞壁，使核物质容易溶解在NaCl溶液中；研磨不充分会使DNA的提取量减少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。

。具体做法。10mL鸡血＋20mL蒸馏水→同方向搅拌→3层尼龙布过滤→滤液 去除滤液中的杂质

为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？

用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。

最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯DNA。

方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。

方案二与方案三的原理有什么不同？

答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。 析出与鉴定

·在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢？得到的DNA呈何颜色？

滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置2～3分钟，析出的白色丝状物就是DNA。DNA呈白色。

·怎样鉴定析出的白色丝状物就是DNA呢？

具体做法。试管2支，编号甲乙→各加等量5mLNaCl溶液→甲中放入少量白色丝状物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均匀→沸水浴5min→观察颜色变化

实验操作

制备鸡血细胞液????加柠檬酸钠，静置或离心 ↓

破碎细胞，释放DNA? 加蒸馏水，同一方向快速通方向搅拌 ↓→过滤，除去细胞壁、细胞膜等。

溶解核内DNA???? 加入NaCl至2mol/L，同一方向缓慢搅拌 ↓

DNA析出?????? 加蒸馏水至0.14mol/L，过滤，在溶解到2mol/L溶液中 ↓→除去细胞质中的大部分物质。

DNA初步纯化???? 与等体积95％冷却酒精混合，析出白色丝状物 ↓→除去核蛋白、RNA、多糖等。

DNA鉴定?????? 二苯胺，沸水浴，呈现蓝色

注意事项：在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓度；使用塑料烧杯；使用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向搅拌；玻棒搅拌要缓慢（细胞破裂快速搅拌）；玻棒不要碰到烧杯壁；二苯胺试剂要现用现配等。

专题六 植物有效成分的提取 课题一 植物芳香油的提取

天然香料的来源：植物、动物

不同植物的根、茎、叶、花、果实、种子都可以提取芳香油。 芳香油的提取方法：蒸馏、压榨、萃取等。

芳香油的性质：挥发性强，成分复杂，以萜类化合物及其衍生物为主。 水蒸气蒸馏法：

原理：水蒸汽可将挥发性较强的芳香油携带出来形成油水混合物，冷却后水油分层。 方法：水中蒸馏：原料放在沸水中加热蒸馏。

水上蒸馏：原料隔放在沸水上加热蒸馏。 水汽蒸馏：利用外来高温水蒸气加热蒸馏。

不足：有些原料不适宜于水中蒸馏，如柑橘、柠檬等易焦糊，有效成分容易水解。通常用压榨法（通过机械压缩力将液相物从液固两相混合物中分离出来的一种简单操作） 萃取法：

原理：芳香油易溶于有机溶剂，溶剂挥发后得到芳香油。如石油醚、酒精、乙醚等。 方法：原料浸泡在溶剂中→得到浸泡液→有机溶剂挥发→芳香油。 不足：有机溶剂中的杂质影响芳香油的品质