临床分子生物学检验学技术
【名词解释】
基因组：是一个细胞或一种生物体的整套遗传物质，包括基因和非编码DNA。
单核苷酸多态性(SNP)：主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。
动态突变(dynamic mutation)：某些单基因遗传病，是由于DNA分子中某些短串联重复序列，尤其是基因编码序列或侧翼序列的三核苷酸重复次数增加所引起，因这种三核苷酸的重复次数可随着世代交替的传递而呈现逐代递增的累加突变效应，所以被称为动态突变。
限制性片段长度多态性(RFLP):是根据不同个体基因组的限制性内切酶的酶切位点的碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同个体DNA水平的差异，即多态性。
变性(denaturation)：待扩增的靶DNA片段在高于其熔点温度Tm的条件下，DNA双螺旋结构中的氢键断裂而解螺旋，形成两条单链分子，这两条单链分子即为扩增反应的模板。
内含子(intron)：断裂基因中不编码的间隔序列称为内含子，内含子是在mRNA被转录后的剪接加工中去除的区域。
外显子(exon)：断裂基因中编码的序列称为外显子，即基因中对应于mRNA序列的区域。
核酸探针：在核酸分子杂交实验中，杂交体必须和单链核酸分子区分开，为此需要对参与杂交反应的核酸分子进行标记，这一段被标记的核酸分子就是探针。
核酸分子杂交：单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程称作核酸分子杂交。
DNA芯片：通过微阵列技术，将大量已知序列的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有序的、高密度的排列固定于支持物上，然后与荧光标记的待测生物样品中的靶核酸分子，根据碱基配对的原则进行杂交，通过检测分析杂交信号的强度及分布，对基因序列及功能进行大规模、高通量的研究。
蛋白质芯片：又称蛋白质微阵列，是将蛋白质或多肽固定在固相载体表面形成微阵列，以获得蛋白质的表达、结构、功能和相互作用的信息。
生物芯片：将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，进而获取样品分子的数量和序列信息。
原癌基因：指普遍存在于人类或其他动物细胞基因组中的一类基因，其在生物进化过程中高度稳定，对细胞无害，而且在控制细胞生长和分化中起重要作用。
抑癌基因(anti-oncogene)：为一类可以编码对肿瘤形成起阻抑作用的蛋白质的基因，正常情况下抑制细胞增殖，促进细胞分化。
最佳条件下的变异(OCV)：是指在某一实验室内，在最理想和最恒定的条件下，对同一质控品进行重复测定，所得出的最低变异，代表该检测项目在该实验室能达到的精密度的最高水平。
常规条件下的变异(RCV)：是指在某一实验室内常规条件下，对同一质控品进行重复测定(至少20次)所得出的变异，反映常规条件下该项目检测的精密度水平。
单基因遗传病：由于一对同源染色体上的单个基因或一对等位基因发生突变所引起的疾病。
线粒体疾病：一组少见的因mtDNA变异而导致线粒体结构和功能异常、细胞呼吸链及能量代谢障碍所致的以脑和肌肉受累为主的多系统疾病。
肽质量指纹图谱：是对蛋白质特异性酶解的多肽混合物进行质谱分析的方法，由于不同蛋白质具有不同的氨基酸序列，被特异性的蛋白酶酶解的肽段具有不同的肽段质量图谱，呈现独特的指纹特征。
全基因组关联分析(GAWS)：是指在人类全基因组范围内找出存在的序列变异，即单核苷酸多态性，从中筛选出与疾病相关的位点。
熔点曲线分析：根据野生序列和突变序列的Tm值不同，产生的熔点曲线不同的特点设计的一种检测核酸突变和多态性的技术。
多重PCR：在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样品中同一靶DNA或不同靶DNA的多个不同序列片段。
巢式PCR：是对靶DNA进行二次扩增，第2次扩增所用的模板为第1次扩增的产物。(通常设计两对引物)
循环数(Ct值)：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值所经过的循环次数。
【填空题】
1.在选择核酸的分离纯化方法，应遵循的总原则是:一是保证核酸(一级结构的完整性)；二是尽可能(排除其他分子的污染，保证核酸样品的纯度)。
2.在PCR反应中, Mg++是个至关重要的因素，浓度(过低)会降低酶的活性，浓度(过高)又会导致非特异性扩增。
3.用于核酸杂交的普通硝酸纤维素膜最大的优点是(本底低)，因而最容易检测杂交信号，缺点是(脆性大)易破裂，且对<500bp的核酸结合力低。
4.整个核酸杂交反应主要由(预杂交)、(杂交)、(洗脱)三个步骤组成。
5.转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上的核酸，其与滤膜的结合是松散的，需做进一步的固定，常用的固定方法是(烘烤)、(紫外线固定)和(碱固定)。
【简答题】
一、原癌基因激活机制： ①点突变 ②易位激活 ③原癌基因扩增
④癌基因甲基化的程度降低
二、抑癌基因失活方式：
①由于DNA点突变或缺失导致一个等位基因失活，如Rb、p53、WT1。
②由于DNA甲基化和组蛋白去乙酰化等表观遗传学机制抑制一个等位基因的表达，最终导致肿瘤的发生。
三、病毒病的检出策略： 1.一般性检出策略：针对病毒的特异性核酸序列，通过分子生物学技术检测病毒的DNA或RNA，仅提供某种病毒是否存在的证据，临床上可用作判断有无病毒感染以及被何种病毒感染，是快速诊断病毒病的首选方法。 2.完整性检出策略：通过分子生物学检验技术，在对病毒的存在与否做出明确判断的基础上进一步检测病毒载量、病毒基因分型、亚型鉴定，以及病毒耐药基因分析。
四、细菌感染的检出策略：
一般性检出策略就是指通过检验直接判断有无细菌感染和是何种细菌感染。完整性检出策略，不仅要对病原菌的存在与否及病原菌的种类作出明确判断，而且还要能够诊断出带菌者和潜在性感染，并能对病原菌进行分类分型和耐药性鉴定。
五、PCR引物设计原则
1.位置:两条引物分别设在被扩增目的片段的两端，并分别与模板正负链碱基序列互补。
2.长度:引物的长度一般为20~30个核苷酸。过长容易形成寡核苷酸链内互补，而成发夹状结构，影响引物与模板之间的结合。引物过短则会降低扩增的特异性。
3.二级结构:两条引物自身或引物之间一般不应存在互补序列，避免形成二级结构或引物二聚体，影响引物与模板的正确结合。4.碱基分布:引物中的四种碱基应随机分布、组成平衡，避免出现嘌呤嘧啶碱基堆积。
5.Tm值:两条引物的Tm值不能差别太大,应控制在2~5°C。
6.末端修饰:延伸是自引物的3'端，因此引物由3'端的几个碱基应与模板严格配对，不能进行任何化学修饰。同时引物3'端最后一个碱基最好不落在密码子的第三个碱基。引物的5'端可加修饰成分，如酶切位点、突变位点等。
六、水解探针技术TaqMan探针原理
反应体系除了有一-对引物外,还需要一条荧光素标记的探针，探针的5'标记荧光报告基团R，探针的3’标记荧光淬灭基团Q。根据荧光共振能量传递(FRET)原理，当完整探针因R基团与Q基团分别位于探针的两端，距离很近而使R基团发射的荧光被Q基团淬灭,导致没有荧光发射。在扩增过程中，Taq DNA聚合酶沿着模板移动合成新链，当移动到与模板互补的探针处时，Taq DNA聚合酶同时还发挥其5'-3'核酸外切酶活性，从探针的5'端逐个水解脱氧核苷三磷酸，R基团与Q基团随之分离，破坏了R基团与Q基团之间的FRET，此时R基团不再受Q基团的抑制而发射出荧光，仪器的检测系统便可检测到荧光信号。
七、简述探针的种类和优缺点
答:1)cDNA探针:通过逆转录获得cDNA后，将其克隆于适当的克隆载体,通过扩增重组质粒而使cDNA得到大量的扩增.提取质粒后分离纯化作为探针使用.它是目前应用最为广泛的一种探针.
2)基因组探针:从基因组文库里筛选得到一个特定的基因或基因片段的克隆后，大量扩增,纯化，切取插入片段，分离纯化为探针.
3)寡核苷酸探针:根据已知的核酸顺序，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段作为探针.
4)RNA探针:采用基因克隆和体外转录的方法可以得到RNA或反义RNA作为探针.
八、蛋白质芯片及原理
将蛋白质或多肽大规模的固定在固相载体表面，形成\集成电路(电子芯片)样\的微阵列,以高通量的获得蛋白质的表达、结构、功能和相互作用的信息。
原理:将已知的蛋白质固定在经特殊化学处理的固相载体上，根据这些生物分子的识别特性(如抗原与抗体、受体与配体、酶与受体)与特异性的待测蛋白反应，从而检测未知蛋白质的表达水平和结构。
九、核酸的分离纯化步骤
核酸分为DNA和RNA,将其从临床标本中提取，是进行分子生物学检验的前提，对后续的实验尤为重要。因而，分离纯化核酸应排除其他分子的污染,并保证核酸结构的完整性。
目前核酸的分离纯化主要包括4个步骤: ①制备细胞及破碎细胞;
②消化蛋白质，去除与核酸结合的蛋白质、多糖及脂类等生物大分子; ③去除其他不需要的核酸分子;
④沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质。
十、双向凝胶电泳原理
双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE )是利用蛋白质的电荷数和分子量大小的差异，通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质的技术。第一向是等电聚焦电泳(iso-electric focusing, IEF)，可根据蛋白质等电点的不同，在pH梯度中将带有不同电荷的蛋白质分离形成区带。将第一向电泳凝胶放入第二向电泳SDS-PAGE中，进行第二次分离，即将具有相同等电点的蛋白质再按照分子量的差别进行二次分离。经双向电泳后得到一系列蛋白质质点，分布在以等电点或分子量为X或Y轴的图谱中，每一个点就代表了-一个或数个等电点和分子量相同的蛋白质。
十一、16SrRNA基因序列分析鉴定细菌原理及优点
1.细菌16SrRNA基因结构特征：16SrRNA基因编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16SRNA),长度约1500bp,存在于所有细菌及衣原体、立克次体、支原体、螺旋体、放线随等原核生物的染色体基因中，不存在于病毒、真菌等非原核生物体内。其序列包含10个可变区和11个保守区，保守区为所有细菌共有，细菌间无差别；可变区因细菌而异，变异程度与细菌的系统发育密切相关。
2.16SrRNA基因序列分析鉴定细菌原理：16SrRNA基因被称为细菌的“分子化石”。16SrRNA基因作为细菌分类鉴定的靶基因具有3个优点:①多拷贝：这使得针对该基因的分子生物学检测具有较高的灵敏度;②多信息:由可变区和保守区组成，可设计保守区的通用引物检测所有细菌，又能利用可变区序列检测特有细菌;③长度适中:长度约为1500bp,既能反映不同菌属之间的差异，又能利用测
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