表18 试纸条检测限的确定：测S1 标准品（10～1 ng/mL）
S1 标准品(ng/mL) 结果判定
7.3.2 猪尿样本添加试验
在ELISA检测为阴性的猪尿样本中添加S1 标准品，添加浓度为1000ng/mL，500 ng/mL，100 ng/mL，50 ng/mL，10 ng/mL，5 ng/mL，1 ng/mL，另设阴性对照样本。所有样本分别用试纸条进行检测。3个批次，两个重复试验。
在ELISA检测为阴性的猪尿样本中添加S1 标准品，添加浓度为10ng/mL，9 ng/mL，8 ng/mL，7 ng/mL，6 ng/mL，5 ng/mL，4 ng/mL，3 ng/mL，2 ng/mL，1 ng/mL，另设阴性对照样本。分别用试纸条进行检测。3个批次，两个重复试验。
结果见表19和表20。由表可知，当猪尿样本中的S1 含量为5 ng/mL以上时，试纸条的检测结果为阳性，据此推断猪尿样本中试纸条的实际检测限为5 ng/mL。
表19 试纸条检测限的确定：猪尿样本添加试验（1000～1 ng/mL） 猪尿样本 (ng/mL) 检测结果
表20 试纸条检测限的确定：猪尿样本添加试验（10～1 ng/mL） 猪尿样本 (ng/mL) 检测结果 7.4
交叉反应试验
阴性样本 10 －
9
8
7
6
5
4
3
2
1
阴性样本 －
500 ＋
100 ＋
50 ＋
10 ＋
5 ＋
1 －
阴性样本 －
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋/－ ＋/－ － － 10 9
8
7
6
5
4
3
2
1
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋/－ － － －
在空白猪尿中分别添加200ng/mL，20ng/mL，5 ng/mL的下列克伦特罗类药物：克仑特罗、沙丁胺醇、特普他林、非诺特罗、马布特罗、西马特罗、溴布特罗、塞曼特罗、异丙肾上腺素，同时设阴性对照，将所有的样本用试纸条进行检测。每个浓度，每份样本作2次重复。
结果见表21。由表可知，添加浓度为时，添加浓度为200ng/mL 、20ng/mL、5 ng/mL时，试纸条只对克仑特罗一种药物的检测结果都为阳性；这表明本实验研制的克伦特罗试纸条对克仑特罗一种药物的交叉反应率为100％。
表21 试纸条交叉反应试验
药物名称 阴性 克仑特罗 － 沙丁胺醇 － 特普他林 － 非诺特罗 － 异丙肾上－ 腺素 实验结果表明本试纸条只对克仑特罗一种药物的交叉反应率为100％。 7.5 重复性试验
实验过程中，由于金标抗体超速离心纯化时重现性较差，每批试纸条组装时都需组装少量试纸条作预实验，重新筛选适宜的浓缩纯化后金标抗体稀释倍数，金标抗体喷涂量以及包被抗原稀释倍数，同时检测不同浓度标准品使试纸条的检测灵敏度符合要求。
制作试纸条时影响因素较多，不同批次的试纸条在检测线显色深浅等方面会有一定的差异。试纸条的组装生产要求在洁净的环境条件下，室温恒定，湿度小于30％。实验室研发试纸条是在一个非标准的环境条件下，随季节气候的变化，实验室的温度、湿度都有一定的变化，这会影响到层析材料的性质和金标抗体的活性，对试剂的展开速度，检测线的显色都有影响。在试纸条的整个研发过程中，从金标抗体的喷涂，检测线上抗原的包被，玻璃纤维素膜的裁剪到试纸条的组装，大多采用手工操作，不可避免的会有一些操作误差。在以后的批量生产工作中，还需对生产流程进行细化，优化，尽可能减小批间差异，保证不同批次试纸条的
2000 ＋ － － － － 200 ＋ － － － － 40 ＋ － － － － 药物名称 阴性 马布特罗 西马特罗 溴布特罗 塞曼特罗 － － － － 2000 200 － － － － － － － － 40 － － － － 稳定性，重复性。
从3个批次的试纸条中分别随机抽取6条试纸条，用于测阴性猪尿样本，5ng/mL的S1 标准品，5ng/mL添加浓度的猪尿样本，每个样本作2次重复。
结果见表22。由表可知，从3个批次的试纸条中随机抽取的试纸条对阴性猪尿样本、5ng/mL S1 标准品、5ng/mL添加浓度猪尿样本检测结果一致，说明不同批次间试纸条重复性较好。
表22 试纸条重复性试验
批次A 批次B 批次C
7.6 保存试验
将制作好的试纸条两条一组置于铝箔袋中，加干燥剂密闭包装，分别置于4℃、 37℃、 室温（20～25℃）条件下，其中置于4℃和室温条件的试纸条每隔7天取出两组，置于37℃每天取出两组，分别检测阴性样本和5ng/mL阳性样本。观察检测线的有无，颜色深浅及玻璃纤维素膜上金标抗体的释放程度。4℃和室温条件下的保存试验持续3个月，37℃条件下保存试验持续7天。
密闭保存于4℃、室温（20～25℃）条件下的试纸条在12次24组检测试验中，检测阴性样本水时检测线清晰，背景白色，结合释放垫上金标抗体释放完全；检测5ng/mL标准品时，对照试纸条检测线清晰，测样试纸条检测线完全消失，符合实验要求。试纸条在37℃条件下的保存到第6天，检测阴性样本水时检测线颜色开始变浅，第7天对照试纸条检测线颜色已很浅，模糊不清。最后确定试纸条的保存条件是两条一组置于铝箔袋中抽真空、加干燥剂室温密闭保存。 7.7 实际测样试验
猪尿样本组织样本处理方法：称取1g匀浆好得组织于离心管中，加1ml 蒸馏水80度水浴10分钟，冷却室温后再3000g以上，室温离心10分钟，取上清
阴性猪尿样本 － － －
－ － －
5ng/mLS1 标准品 ＋ ＋ ＋
＋ ＋ ＋
5ng/mL添加浓度猪尿样
本
＋ ＋ ＋
＋ ＋ ＋
检测。稀释倍数：1倍，各取100μL用ELISA试剂盒直接进行检测，再各取100μL用试纸条进行检测。
试纸条对300份猪尿样本的结果见表23。 300份猪尿样本中有234份为阴性，其余66份样本检测结果为阳性。其中33、104、142、190、200、295样本ELISA方法检测为阴性，而试纸条显示为阳性。从该表可以看出，
ELISA试剂盒对300份猪尿样本的结果见表23，含量大于5ng/mL判断为阳性，小于5ng/mL判断为阴性。300份猪尿样本中有240份阴性样本，其余60份猪尿样本为阳性。
从该表可以看出，试纸条检测结果和ELISA检测结果阳性样本符合率为100％，阴性样本符合率约为93%以上。
如图4～10，为试纸卡检测1～100号的鸡肉样本照片，为了简洁以下检测样本照片略。
表23 试纸卡与试剂盒方法对比
试纸条对提取后的300份鸡肉组织样本的检测结果 1 ＋ 21 — 41 — 61 — 81 — 101 — 121 ＋ 141 — 161 — 181 — 201 2 — 22 — 42 — 62 — 82 — — — ＋ — — 3 — 23 — 43 — 63 — 83 — — — — — — 4 — 24 — 44 ＋ 64 — 84 — ＋ — — ＋ — 5 — 25 — 45 — 65 ＋ 85 ＋ 105 — 125 ＋ 145 — 165 — 185 — 205 6 — 26 — 46 — 66 ＋ 86 ＋ 106 — 126 — 146 ＋ 166 — 186 — 206 7 ＋ 27 — 47 — 67 — 87 — 107 — 127 — 147 — 167 — 187 ＋ 207 8 ＋ 28 — 48 — 68 — 88 — 108 — 128 ＋ 148 — 168 — 188 — 208 9 — 29 — 49 — 69 — 89 — 109 ＋ 129 — 149 — 169 ＋ 189 — 209 10 — 30 — 50 — 70 ＋ 90 ＋ 110 — 130 — 150 ＋ 170 — 190 ＋ 210 12 — 31 ＋ 51 — 71 — 91 — 111 — 131 ＋ 151 — 171 — 191 — 211 12 — 32 — 52 — 72 — 92 — 112 — 132 ＋ 152 — 172 — 192 — 212 13 — 33 ＋ 53 — 73 ＋ 93 ＋ 113 — 133 — 153 — 173 — 193 — 213 14 — 34 — 54 — 74 — 94 ＋ 114 — 134 — 154 — 174 ＋ 194 — 214 15 ＋ 35 — 55 — 75 ＋ 95 — 115 ＋ 135 — 155 ＋ 175 — 195 — 215 16 — 36 ＋ 56 — 76 — 96 — 116 — 136 — 156 — 176 ＋ 196 — 216 17 — 37 — 57 — 77 — 97 — — ＋ — — — 18 — 38 — 58 — 78 ＋ 98 — — ＋ — — ＋ 19 — 39 ＋ 59 — 79 — 99 ＋ 119 — 139 — 159 — 179 — 199 — 219 20 — 40 — 60 — 80 — 100 — 120 — 140 — 160 ＋ 180 — 200 ＋ 220 102 103 104 122 123 124 142 143 144 162 163 164 182 183 184 202 203 204 117 118 137 138 157 158 177 178 197 198 217 218 — 221 ＋ 241 — 261 — 281 ＋ — — — ＋ — ＋ — — — — ＋ — — — — — 225 — 245 — 265 — 285 — — 226 — 246 ＋ 266 ＋ 286 — — 227 — 247 ＋ 267 — 287 — ＋ 228 ＋ 248 — 268 — 288 ＋ — 229 ＋ 249 — 269 ＋ 289 — — 230 — 250 — 270 — 290 — — 231 — 251 — 271 — 291 — ＋ 232 — 252 — 272 — 292 — ＋ 233 — 253 — 273 ＋ 293 — — 234 — 254 — 274 — 294 — — 235 ＋ 255 — 275 — 295 ＋ — 236 — 256 ＋ 276 — 296 — — — — — — — — — ＋ ＋ — 239 ＋ 259 — 279 — 299 — — 240 — 260 — 280 — 300 — 221 223 224 242 243 244 262 263 264 282 283 284 237 238 257 258 277 278 297 298 ELISA 对提取后的300份鸡肉组织样本的检测结果 1 21 0.6 41 0.5 61 2.3 81 0.6 101 0.2 121 9.8 141 2.5 161 0.9 181 0.3 201 2.3 221 6.3 241 2.0 261 0.9 281 6.9 2 22 2.3 42 2.6 62 0.1 82 2.2 2.1 0.5 4.6 1.1 2.0 0.4 3.0 1.4 8.9 3.5 3 1.3 23 4.0 43 3.2 63 2.4 83 3.0 3.6 1.4 6.9 1.3 1.6 9.2 4.4 0.9 1.3 4.0 4 2.2 24 1.9 44 6.5 64 0.3 84 1.4 4.0 2.3 0.6 5 0.5 25 0.6 45 0.5 65 85 105 0.3 125 9.8 145 4.5 165 185 0.4 205 225 2.1 245 3.3 265 4.6 285 2.5 6 2.6 26 1.7 45 1.1 66 86 106 1.3 126 0.1 146 166 0.9 186 1.6 206 2.5 226 0.9 246 266 286 0.9 7 5.9 27 2.2 47 1.3 67 2.1 87 0.6 107 0.2 127 2.5 147 167 3.6 187 6.6 207 3.4 227 3.1 247 267 287 3.4 8 7.2 28 1.0 48 0.6 68 0.6 88 3.4 108 1.3 128 9.3 148 0.6 168 1.4 188 4.0 208 9.9 228 9.5 248 268 2.3 288 9 0.6 29 0.9 49 2.5 69 3.7 89 1.8 109 129 3.3 149 3.3 169 8.5 189 0.9 209 1.7 229 6.4 249 1.2 269 289 10 2.5 30 1.3 50 3.6 70 90 8.9 110 130 0.3 150 6.9 170 1.8 190 3.2 210 0.4 230 1.4 250 1.7 270 290 1.8 12 6.3 31 51 1.5 71 91 3.4 111 2.3 131 151 1.4 171 2.0 191 2.2 211 4.8 231 0.5 251 2.5 271 1.2 291 4.5 12 1.5 32 52 0.9 72 0.7 92 1.1 112 0.8 132 152 4.5 172 3.3 192 0.6 212 232 3.2 252 1.4 272 0.6 292 0.9 13 2.2 33 3.7 53 0.2 73 93 113 1.3 133 153 0.9 173 1.4 193 3.4 213 233 0.8 253 3.2 273 8.1 293 2.6 14 0.1 34 2.2 54 0.9 74 94 114 1.8 134 3.3 154 3.4 174 194 1.7 214 234 1.1 254 0.4 274 2.5 294 3.3 15 6.9 35 1.5 55 3.1 75 95 115 8.5 135 1.4 155 175 195 0.8 215 0.7 235 255 1.7 275 1.3 295 4.5 16 2.8 36 7.0 56 0.5 76 96 0.6 116 0.3 136 0.3 156 176 196 2.9 216 0.3 236 256 5.9 276 3.4 296 0.9 17 1.1 37 2.1 57 1.1 77 3.4 97 3.5 1.2 6.9 2.5 18 4.4 38 3.5 58 0.4 78 6.3 98 0.4 0.5 19 3.2 39 8.5 59 0.9 79 0.8 99 119 1.6 139 159 1.7 179 2.5 199 219 0.9 239 259 1.3 279 2.7 299 20 1.2 40 0.9 60 1.1 80 1.7 100 120 2.0 140 0.4 160 15.3 180 0.8 200 3.0 220 1.5 240 260 1.3 280 3.5 300 5.7 10.5 0.6 13.5 1.2 12.6 5.9 15.9 6.0 20.5 3.3 15.7 1.4 10.5 1.4 13.5 20.5 0.2 11.4 1.5 102 103 104 122 123 124 142 143 144 162 163 164 182 183 184 3.0 202 203 204 222 223 224 0.6 1.6 0.8 0.3
242 243 244 262 263 264 282 283 284 117 118 137 138 157 158 3.4 6.9 177 178 197 198 0.4 3.2 4.5 1.4 0.8 1.1 217 218 2.1 3.3 0.9 6.4 237 238 257 258 277 278 297 298 12.5 3.4 10.9 23.5 2.5 12.8 2.5 12.5 2.4 12.9 0.4 24.6 2.4 13.5 0.3 20.9 3.3 20.9 2.2 30.5 1.4 11.5 16.9 3.4 23.5 0.3 30.5 3.1 24.5 30.8 3.5 10.5 1.4 13.6 0.4 12.8 4.0 19.8 4.0
克伦特罗胶体金免疫层析试纸条的技术报告
