3.4 金标抗体的纯化（超速离心法步骤）
3.4.1 金标抗体溶液常温低速（1500rpm）离心20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀。红色上清溶液4℃，11000rpm 离心40min。
3.4.2 溶液分为三层，透明上清，管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用含1％RSA的0.01mol/L PB混悬至原量。
3.4.3 平衡过夜，同上重复离心2次。
3.4.4最后用1％BSA的0.01mol/L PB（含 0.02% NaN3）将沉淀混悬为原体积的1/40，4℃保存。 3.5 金标抗体的质量鉴定
将羊抗兔二抗点样于NC膜上，直接与金标S1单抗作用，可见有明显的粉红色斑点，表明金标抗体有活性。 4 包被抗原的合成与筛选
用于胶体金免疫层析试验的抗原和抗体必须有足够的敏感行、特异性和反应结合位点，能够和膜材料结合并与待测样品发生特异性反应。本实验中共合成了3种包被抗原，在ELISA反应中都能和单抗发生特异性反应，但将3种抗原包被到NC膜上后，只有包被抗原B能与胶体金标记的单抗发生良好的显色反应。这可能涉及到不同方法合成的包被抗原和NC膜的结合能力不同，同金标抗体的特异性结合反应也有差异，最后导致显色结果的不同。
用不同方法共合成了三种包被抗原：包被抗原A，包被抗原B和包被抗原C。 4.1 包被抗原A的合成
4.1.1 取盐酸克伦特罗40mg用0.1M/L的HCL1.5ml溶解完全。
4.1.2 滴加1％ NaNO2(过量)，4℃持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉－碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50 mmol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘。碘再与淀粉反应变成兰黑色。 4.1.3 溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。
4.1.4 取OVA100mg用5mlpH9.0 浓度为200 mmol/L的硼酸缓冲液溶解。 4.1.5 边搅拌边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量），调节pH至9.5 4.1.6冰箱中搅拌反应2小时，不断调节pH至9.0。
4.1.7 用PBS透析2天。得包被原1。 4.2 包被抗原B的合成
4.2.1 用0.5 ml 0.1mmol/L pH6.8的PBS稀释GA至浓度0.15 mmol/L 4.2.2 10mg盐酸克伦特罗溶于0.5 mlGA溶液中， 4.2.3 取OVA80mg用 4.5ml双蒸水溶解。
4.2.4 将溶液（2）逐滴加入到溶液（3）中。室温下搅拌反应24小时。 4.2.5 用0.02M的PBS透析三天，每8小时换一次液。得包被原2。 4.3 包被抗原C的合成
4.3.1 取EDC100mg，用pH8.0的10mmol/L PBS液1.5mL使之充分溶解（Ⅰ液）。 4.3.2 取盐酸克伦特罗40mg，用2ml双蒸水溶解（Ⅱ液）。
4.3.3 取OVA100mg，溶于3ml10 mmol/L PBS （PH8.0）液中（Ⅲ液）。 4.3.4 将Ⅱ液与Ⅲ液混合，在磁力搅拌下逐滴加入Ⅰ液（余下0.5ml）。 4.3.5 室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的Ⅰ液。 4.3.6 4度搅拌12小时。 4.3.7 静置10小时（4度）。
4.3.8 用蒸馏水使之充分透析（约48小时），得包被原3。 4.3 抗原的筛选
将三种包被抗原分别稀释到0.5mg/mL，再分别作1：25、1：50、1：100、1：150、1：200、1：250、1：300稀释，在NC膜上点样，37℃温箱中干燥后，直接浸泡于金标抗体溶液中，观察不同抗原点样点的显色情况。
包被抗原C的点样显色非常浅，肉眼几乎无法分辨，包被抗原A最高稀释倍数为1：100，而包被抗原B的最高稀释倍数可达到1：250，故选择包被抗原B用于试纸条的组装。 5抗原包被各种溶液的筛选 5.1抗原包被液和包被条件的选择
分别用A、B、C、D、E五种不同配方的包被液将包被抗原作1：100，1：150，1：200，1：250，1：300稀释，在NC膜上点样后37℃ 10min烘干，用封闭液封闭后，滴加2倍稀释的纯化后金标抗体，反应8min后，洗涤液洗涤，观察显色情况。
5.1.1包被液和包被条件的选择
判断标准：
＋＋＋ 表示着色很深，与背景反差很大； ＋＋ 表示着色较深或着色很深但背景色也较深； ＋ 表示着色淡或着色较深但有背景色； — 表示没有着色，或与背景色没有反差。 包被液筛选结果见表3。
表3 包被液筛选结果
包被液 1:100 1:150 1:200 1:250 1:300
A ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ －
B ＋＋＋ ＋＋ ＋ － －
C ＋＋＋ ＋＋ ＋ ＋ －
D ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ －
E ＋＋ ＋ － － －
由表可知，包被液D在1:250稀释后，NC膜上点样着色照样很深，而其他包被液在1:250稀释后，颜色很淡或不显色，故选择包被液D作为实际用包被稀释液。
用包被液D将包被抗原作1：100，1：150，1：200，1：250，1：300稀释，在NC膜上点样后分别37℃ 10min烘干和室温（20～25℃）30min自然干燥，其他条件不变，观察显色情况。包被条件筛选结果见表4。
表4 包被条件筛选结果
包被液D 37℃ 10min 室温（20～25℃）
30min
由表可知，点样后，包被液在37℃ 10min烘干和室温（20～25℃）30min自然干燥的不同包被条件差异不显著。为缩短试验过程，包被条件选择37℃ 10min烘干。
5.2封闭液和封闭条件的选择
1:100 ＋＋＋ ＋＋＋
1:150 ＋＋＋ ＋＋＋
1:200 ＋＋＋ ＋＋＋
1:250 ＋＋ ＋＋
1:300 － －
包被抗原点样干燥后, 分别用A、B、C、D四种不同配方的封闭液进行封闭，其他条件不变，观察点样点和NC膜的显色情况。封闭液筛选结果见表5。
表5 封闭液筛选结果
封闭液 显色情况
A ＋＋
B ＋＋＋
C ＋＋
D ＋＋
由表可知，封闭液B封闭后得到的斑点颜色很深，作为背景的NC膜呈白色，同斑点颜色反差非常大，说明封闭液B封闭效果很好，将NC膜上的一些结合位点进行了封闭，使金标抗体不在NC膜上结合停留，除抗原点样处为红色，NC膜其他位置都为白色。封闭液A、C、D封闭后得到的斑点颜色也很深，但NC膜上呈深浅不一的粉红色，降低了斑点同背景的反差。说明封闭液B封闭效果比其他三种封闭液封闭效果好。
包被抗原点样后，用封闭液B以不同的封闭时间10min、30min、45min、60min、120min分别在室温（20～25℃）、37℃条件下进行封闭，其它条件不变，观察显色情况。
表6 封闭条件筛选结果
封闭时间（min）
37℃ 室温（20～25℃）
10 ＋＋＋ ＋＋
20 ＋＋＋ ＋＋＋
40 ＋＋＋ ＋＋＋
60 ＋＋＋ ＋＋＋
120 ＋＋＋ ＋＋＋
封闭条件筛选结果见表6。由表可知，看出抗原点样后，37℃和室温条件下封闭10～120min均能得到着色较深、背景较浅的斑点。为缩短试验时间，37℃封闭10min。
5.3 金标抗体稀释液的选择
20mL标记好的金标抗体经超速离心纯化后得到200μL浓缩金标抗体，分别用金标抗体稀释液A、B、C、D、E作2倍稀释后，滴加到经点样、封闭后的NC膜上，观察显色情况。金标抗体稀释液筛选结果见表7。
表7 金标抗体稀释液筛选结果
金标抗体稀释液 显色情况
A ＋＋＋
B ＋＋
C ＋＋
D ＋
E ＋
由表可知，其他条件相同的情况下，经稀释液A稀释后的金标抗体滴加到
NC膜上得到的斑点颜色最深，最清晰。
20mL标记好的金标抗体经超速离心纯化后得到200μL浓缩金标抗体，用金标抗体稀释液A分别作0.5倍、1倍、2倍、4倍、6倍稀释后，滴加到经点样、封闭后的NC膜上，观察显色情况。金标抗体稀释倍数选择结果见表8。
表8 金标抗体稀释倍数选择结果
稀释倍数 显色情况
0.5倍 ＋＋＋
1倍 ＋＋＋
2倍 ＋＋＋
4倍 ＋
6倍 －
由表可知，浓缩纯化后的金标抗体作2倍稀释比较合适，单稀释倍数超过2倍后，NC膜上斑点颜色较浅或不显色。 6 试纸条组成材料的选择
6.1用于胶体金免疫层析试验的膜多为硝酸纤维素膜（NC膜），对NC膜的选择常有以下要求：
6.1.1蛋白结合力: NC膜与蛋白质结合的机理是静电引力。胶体金免疫层析试验用的NC膜IgG的结合力常为100～180μg/cm2。
6.1.2孔径大小：孔径大小是一个关键因素，免疫层析试验使用的膜孔径多为0.5～1.0μm。
6.1.3层析速率：层析速率可用两种方式表示，单位时间层析流动的距离(cm/min)和单位长度层析流动所需时间(s/4cm)。本试验供筛选的3种NC膜的层析速率见表9：
表9 NC膜的层析速率
膜的类型 AE 100 AE 98 Fast CN140
层析速率(s/4cm)
90～120 110～160 130~150
厚度(μm) 120 120 120
6.1.4膜的厚度：厚度对层析速率影响不大。
6.1.5抗张强度：膜的可拉伸强度和弹性范围，如果膜的抗张强度太低在制备过程中会出现类似于断膜等许多问题。 6.2 硝酸纤维素（NC）膜的选择
6.1.1 用包被抗原在AE 100、AE 98 Fast、CN140三种NC膜上分别点样，干燥、
克伦特罗胶体金免疫层析试纸条的技术报告
