LMP1调节鼻咽上皮与鼻咽癌组织中p27与RPLP0蛋白的表达

LMP1调节鼻咽上皮与鼻咽癌组织中p27与RPLP0蛋白的表

达*

赵 强2，张志伟1△，刘重元1，杨 科1，谢 妮1，张 婕3

【摘 要】[摘 要]目的:观察p27和核糖体磷酸化蛋白大亚基P0(RPLP0)蛋白在潜伏膜蛋白1(LMP1)阳性鼻咽癌细胞中的表达，揭示蛋白质之间的相互作用规律及临床病理学意义。方法:采用Western blotting分析p27和RPLP0蛋白表达与LMP1表达之间的关系，S－P免疫组织化学染色检测LMP1、p27和RPLP0蛋白在30例鼻咽上皮组织和60例鼻咽低分化鳞状细胞癌中表达，并分析其临床病理学意义。结果:(1)LMP1在鼻咽上皮和鼻咽低分化鳞状细胞癌中的阳性表达率分别为73.3%和90.0%;(2)与LMP1(－)组织比较，p27蛋白在LMP1(+)的鼻咽上皮和鼻咽低分化鳞状细胞癌中表达降低，而RPLP0蛋白表达与之相反;(3)p27蛋白和RPLP0蛋白表达与鼻咽癌患者年龄、LMP1蛋白的表达、淋巴结转移及TNM分期有关(P＜0.05)，患者年龄小、LMP1(－)、无淋巴结转移、TNM I期和II期时，p27蛋白表达阳性率较高，而RPLP0蛋白表达则反之(P＜0.05)。结论:LMP1在鼻咽上皮和鼻咽低分化鳞状细胞癌中下调p27和上调RPLP0蛋白的表达;鼻咽癌患者年龄小、LMP1(－)、无淋巴结转移、TNM I期和II期时，p27蛋白表达阳性率较高，而RPLP0蛋白表达则与之相反。【期刊名称】中国病理生理杂志【年(卷),期】2012(028)010【总页数】5

【关键词】[关键词]鼻咽上皮;鼻咽肿瘤;潜伏膜蛋白1;p27蛋白;核糖体磷蛋白大亚基P0

EB病毒(Epstein－Barr virus，EBV)感染与鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)的发生密切相关[1]，其编码的潜伏膜蛋白 1(latent membrane protein 1，LMP1)是重要的致瘤蛋白[2]。羧基端胞浆区是LMP1将信号转导至细胞内、活化不同信号通路而发挥其生物学功能的重要部位，包含3个羧基端功能活性区(carboxyl terminal activating region，CTAR)，即 CTAR1、CTAR2和 CTAR3[3－4]。前期，我们筛选到LMP1调节的p27与核糖体磷蛋白大亚基P0(ribosomal

phosphoprotein large P0，RPLP0)蛋白[5，12]。为进一步了解LMP1与调节蛋白质在组织中表达相关性，本文检测LMP1调节的p27与RPLP0蛋白在鼻咽上皮和鼻咽低分化鳞状细胞癌中的表达情况，分析蛋白质间的相互调节规律及临床病理学意义，为揭示EB病毒与鼻咽癌发病的分子机制提供实验资料。

材料和方法

1 材料

收集2009年8月～2010年10月南华大学附一医院的鼻咽上皮组织石蜡块30例(其中男性18例，女性

12例，平均年龄35岁)和鼻咽低分化鳞状细胞癌组织石蜡块60例(其中男性41例，女性19例，平均年龄44.5岁)。另外收集鼻咽部活检新鲜标本鼻咽上皮组织和鼻咽低分化鳞状细胞癌组织各10例，其中LMP1阳性组织各5例。2 免疫组织化学染色

将制备好的石蜡切片二甲苯脱蜡2次后水化;PBS洗片3次，每次3 min;浸入盛有枸橼酸盐缓冲液容器中微波炉加热进行抗原修复;加3%过氧化物酶阻断液，37℃ 15 min;PBS洗片3次，每次3 min;加足量非免疫性动物血清，37℃ 10 min;分别滴加Ⅰ抗(抗LMP1和p27蛋白抗体为福建迈新生物技术有限公司产品，克隆号为 CS1－4和 MAB－0242;RPLP0蛋白抗体为Abcam产品，克隆号为DCS－72.F6)，置湿盒中4℃冰箱过夜;滴加生物素标记的Ⅱ抗，37℃ 15 min;滴加链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶溶液，37℃ 15 min;DAB显色、苏木素复染、返蓝、脱水、透明，封片，显微镜观察、照相。阳性表达的判断标准:浅黄色为弱阳性，黄色或棕黄色为中等阳性，棕色或深棕色为强阳性，无棕黄色或与背景着色一致为阴性。3 Western blotting检测蛋白表达

将收集的活检鼻咽上皮组织与鼻咽癌组织按照LMP1(－)或(+)分别混合，剪碎、裂解、提取蛋白，测定蛋白浓度，以每孔30 μg总蛋白，经10%SDS不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，转膜、封闭，p27或RPLP0蛋白Ⅰ抗(购自Santa Cruz;1∶1000)和Ⅱ抗(购自 Santa Cruz;1∶2000)孵育、发光、曝光、显影、定影和分析结果。4 统计学处理

采用 SPSS 13.0软件进行数据处理，p27和RPLP0蛋白的表达采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 鼻咽上皮和鼻咽低分化鳞状细胞癌组织中LMP1蛋白的表达

LMP1蛋白表达于胞膜和胞浆，见图1，其中鼻咽上皮组织的表达率为73.3%，而鼻咽低分化鳞状细胞癌组织中表率为90.0%，见表1，提示正常人群和鼻咽低分化鳞状细胞癌患者组织中EBV感染率均较高。

2 鼻咽上皮和鼻咽低分化鳞状细胞癌组织中p27蛋白的表达

p27蛋白表达于细胞核，见图2。与LMP1(－)组织相比，p27蛋白在LMP1(+)的鼻咽上皮组织和鼻咽低分化鳞状细胞癌中表达降低，见图3，提示LMP1抑制鼻咽上皮组织和鼻咽低分化鳞状细胞癌中p27蛋白的表达。

3 鼻咽上皮和鼻咽低分化鳞状细胞癌组织中RPLP0蛋白的表达

RPLP0蛋白表达于胞核和胞浆，见图4。与LMP1(－)组织比较，RPLP0蛋白在LMP1(+)的鼻咽上皮组织和鼻咽低分化鳞状细胞癌中表达升高，见图3，提示LMP1促进鼻咽上皮组织和鼻咽低分化鳞状细胞癌组织中RPLP0蛋白的表达。

4 p27和RPLP0蛋白表达与鼻咽癌临床病理的关系

p27和 RPLP0蛋白表达与鼻咽癌患者年龄、LMP1蛋白的表达、淋巴结转移及TNM分期有关(P＜0.05)，其中患者年龄小、LMP1蛋白的表达阴性、无淋巴结转移、TNM分期I和II期时，p27蛋白表达阳性率相对较高，而RPLP0蛋白表达则与之相反(P＜0.05);另外2种蛋白表达均与患者性别无关(P＞0.05)，见表1。

讨 论

鼻咽癌是我国南方地区如广东、广西、湖南和香港等常见的恶性肿瘤之一，其发生涉及遗传、EB病毒感染、饮食及地理等诸多因素，是一个多基因、多途径和多阶段的复杂生物学过程，属多基因遗传性疾病[1－2]。为揭示EB病毒在鼻咽癌发生发展中的作用机制，我们前期选取EB病毒编码的重要致瘤蛋白LMP1进行了相关研究，采用蛋白质组学方法，筛选获得包括p27与RPLP0蛋白等在内的39个LMP1调节的蛋白质[5]。为了进一步证实LMP1在鼻咽上皮与鼻咽癌组织中对上述蛋白表达的影响，我们选取其中2个肿瘤相关且表达差异最大的蛋白p27和RPLP0，检测了它们分别在鼻咽上皮和鼻咽癌组织中的表达情况，并分析与LMP1表达的相关性，为阐明LMP1在鼻咽癌发生、发展中的作用机制提供了实验依据。

p27蛋白是一种广谱细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin－dependent kinase，CDK)抑制剂，属于细胞周期负性调节因子CDKI家族成员之一，通过抑制cyclin/CDK复合物的活性，阻止Rb磷酸化，使细胞周期停滞于G1期，抑制细胞增殖，在真核细胞周期调控中起到重要作用[6－7]。至今，已经在多种肿瘤中检测到p27表达下降或者缺失，如口腔鳞状细胞癌[8]、淋巴瘤[9]、前列腺癌[10]和乳腺癌[11]等，提示p27表达的降低可能与肿瘤的发生、发展有关。我们在鼻咽上皮组织与鼻咽低分化鳞状细胞癌中检测发现，LMP1表达后细胞中p27蛋白表达降低，结果提示LMP1可能参与抑制p27蛋白的表达。LMP1作为EB病毒编码的重要致瘤蛋白，通过多条信号转导途径参与促细胞的增殖，及诱导细胞恶变[12－13]。因此，我们推测LMP1抑制p27蛋白的表达可能在发挥其致瘤过程中起一定的作用。另外，我们分析了解到患者年龄小、LMP1(－)、无淋巴结转移、TNM I期和II期时，p27蛋白表达阳性率相对较高，结果说明p27蛋白的表达与鼻咽癌的发生发展及转移有一定的关系，我们推测LMP1可能通过抑制该蛋白的表达促进鼻咽癌的转移，但具体分子机制有待后续继续深入。

RPLP0作为核糖体大亚基上的一个重要组成部分，参与调节蛋白质的合成过程，是维持核糖体稳定性和活性必不可少的[14]。完整的RPLP0蛋白是保持细胞活性所必需的，其参与蛋白合成延伸阶段的调节作用，在蛋白翻译的延伸阶段有利于mRNA的移动和脱酰tRNA的移开。当其缺失后可导致60S rRNA 组装严重不足，最终导致细胞死亡[15－16]。我们检测发现，LMP1在鼻咽上皮细胞和

鼻咽低分化鳞状细胞癌中表达，RPLP0蛋白表达增加，推测LMP1促进细胞增殖，调节细胞内RPLP0蛋白的表达，稳定并增强核糖体蛋白的功能，促进细胞内蛋白质的合成，为细胞的分裂与增殖提供必需的物质基础，但其中可能的调节机制需我们进一步深入研究。另外，我们观察到鼻咽癌发生淋巴结转移和晚期患者中RPLP0蛋白表达阳性率高，提示该蛋白有望成为评估患者分期与预后的检测指标之一，由于样本量有限，临床应用前仍有待大样本的进一步分析证实。[参考文献]

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*[基金项目]湖南省自然科学联合基金资助项目(No.12JJ9033);湖南省高校创新平台开放基金资助项目(No.10K052);湖南省重点学科建设基金资助项目(No.2006－180);湖南省研究生科研创新项目(No.CX2010B380);湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目

(No.CXSY－SJ－09007;No.CXSY－SJ－10192);湖南省教育厅科研项目(No.11C1112);衡阳市科技局科研项目(No.2011kj52;No.2011kj53)

△通讯作者 Tel:0734－8281510;E－mail:zhangzhiweichina@yahoo.com.cn