细胞角蛋白17在口腔鳞癌中的表达
魏魁杰1 张雷2 杨筱2 韩伟2 钟来平2 叶冬霞2 张志愿2
【摘 要】[摘要]目的 研究细胞角蛋白17（CK17）在口腔鳞癌中的表达，以期为口腔鳞癌的诊断和预防提供依据。方法 分别采用实时定量聚合酶链反应、免疫印迹方法和免疫组化方法检测口腔黏膜上皮体外癌变模型、口腔鳞癌细胞株及30例原发口腔鳞癌标本中的CK17 mRNA及蛋白质的表达。结果 与永生化HIOEC细胞相比，CK17 mRNA在HB56和OSC细胞株中表达明显升高，CK17蛋白表达水平在所有细胞株中均有不同程度的升高。口腔鳞癌患者癌组织中CK17的mRNA和蛋白表达水平均显著高于癌旁组织（P＜0.01）。结论 CK17表达上调可能与口腔鳞癌的发生、发展有关。 【期刊名称】华西口腔医学杂志 【年(卷),期】2011(029)004 【总页数】5
【关键词】[关键词]细胞角蛋白17； 口腔鳞癌； 实时定量聚合酶链反应； 免疫印迹； 免疫组织化学
口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，患者5年生存率约为50%，对于肿瘤晚期和复发患者，生存率更低[1]。因此寻找有效的生物标志物、阐明其发病机制十分重要。
本研究利用口腔黏膜上皮体外癌变模型[2-3]，在前期工作中采用比较蛋白质组学技术，鉴定出癌变形成细胞较永生化细胞高表达的细胞角蛋白17（cytokeratin 17，CK17）。CK17是构成细胞骨架的一种酸性多肽，在乳腺癌、子宫颈癌、肺癌等多种恶性肿瘤中高表达[4-7]。本研究旨在探讨CK17在口腔
黏膜上皮体外癌变模型、口腔鳞癌细胞株及临床组织标本中的表达情况及临床意义，以期为口腔鳞癌的诊断和预防提供依据。
1 材料和方法
1.1 试剂与器材
细胞培养基Defined keratinocyte-SFM、DMEM和RPMI-1640（Gibco公司，美国），RNA提取试剂（Invitrogen公司，美国），实时荧光定量试剂盒（TaKaRa公司，日本），Western鼠抗荧光抗体（Fermentas公司，立陶宛），EnVision鼠兔共抗二抗（Dako Cytomation公司，丹麦），CK17鼠抗人单克隆抗体（Millipore公司，美国），Odyssey激光成像分析系统（LI-COR Biosciences公司，美国）。 1.2 细胞培养
口腔黏膜上皮体外癌变模型中的永生化细胞（human immortalized oral epithelia cell，HIOEC）、HB56及HB96细胞、舌鳞癌细胞株Tca8113均由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科肿瘤生物实验室建系，舌鳞癌细胞株TSCC由武汉大学口腔医学院建系并惠赠，CAL27购自美国American Type Culture Collection（ATCC）公司，口腔鳞癌细胞株OSC由日本高知大学医学院惠赠。HIOEC采用Defined keratinocyte-SFM培养，HB56、HB96和CAL27采用DMEM（含10?S，2×105 U·L-1青、链霉素）培养，Tca8113、TSCC、OSC细胞用RPMI-1640（含10?S，2×105 U·L-1青、链霉素）培养。所有细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养。 1.3 组织标本
选取2007年2—7月上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科手术
切除的原发口腔鳞癌组织标本30例，患者术前未经过放、化疗，且均知情同意。30例患者中，男性21例，女性9例；年龄31～84岁，平均年龄53.8岁。根据国际抗癌联盟（Union Internationale Contre Le Cancer，UICC）2002分类，T1 6例，T2 13例，T3 4例，T4 7例；N0 16例，N1-2 14例；临床分期：Ⅰ、Ⅱ级（早期）13例，Ⅲ、Ⅳ级（晚期）17例；病理分级：高分化12例，中分化15例，低分化3例。术中切取肿瘤实体内组织和肿瘤边界2 cm外的癌旁组织立即投入液氮后转移至-80℃冰箱保存备用，癌旁组织经病理证实为正常黏膜组织。 1.4 实时定量聚合酶链反应
待细胞丰度至70%～80%，按1×107收集细胞，移入1.5mL离心管中；取组织块约50mg置研钵中，加入液氮后迅速研磨成粉末状，分别加入1mL Trizol，根据RNA提取试剂盒操作步骤分别抽提各细胞及癌与癌旁组织总RNA，测定质量浓度。取2μg总RNA，按反转录试剂盒步骤进行反转录为cDNA，然后采用20μL反应体系，以cDNA为模板进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。PCR
扩增
CK17
上游序列：5’-
GAGATTGCCACCTACCGC-3’，下游序列：5’-TGCCATCCTGGACCTCTT-3’，扩增片段的长度为118 bp。内参照β-肌动蛋白上游序列：5’-TGGATCAGCAAGCAGGAGTAT-3’
，
下
游
序
列
：
5’-
GGTTTTGTCAAGAAAGGGTGTAACG-3’，扩增片段的长度为100bp。反应条件为：预变性95℃、10 s，95℃、5 s，60℃、30 s，共40个循环，β-肌动蛋白作为内参照，实验重复3次。根据Livak等[8]推导的2-ΔΔCt分别计算细胞系中目的基因相对内参基因的相对表达量以及口腔鳞癌癌组织相对癌旁组
细胞角蛋白17在口腔鳞癌中的表达
