校园河水中的生物检测与水体水质评述 实验报告
环科1212 朱佳超 1220207214
一、实验目的：
1.学会运用环境微生物学、环境监测和环境评价等课程的相关知识点和实验技能，结合环境评价知识对所检测的水样（水体）作综合分析和评述。
2.通过对相关知识点的综合学习和应用，进一步加深对基础知识的理解，并强化基本功的训练。
二、实验原理：
1. 浮游生物泛指生活于水中而缺乏有效移动能力的漂流生物，其中分有浮游植物及浮游动物。浮游植物又称浮游藻类，是水中悬浮生活的若干种藻类的总称。浮游植物及其生产力是水生态系统的重要成员与重要功能之一，是鱼类天然饵料的重要组成部分。由于浮游植物对环境的变化十分敏感，故在环境监测中，也有重要作用。
2. 水中细菌总数往往同水体受有机物污染的程度呈正相关。因此，它是评价水质污染程度的—个重要指标之一。由于重金属及某些其它的有毒物质对细菌有杀灭或抑制作用，在总细菌数少的水样中并不能排除这些物质的污染。 本实验采用标准平皿法对水样中细菌作计数，这是测定水中好氧和兼性厌氧异养细菌密度的方法。由于细菌在水体中能以单独个体、成对、链状、成簇或成团的形式存在，此外没有单独的一种培养基或其一环境条件能满足—个水样中所有细菌的生理要求，所以由此法所得的菌落数实际上要低于被测水样中真正存在的活细菌的数目。细菌总数是指1mL水样在营养琼脂培养基中，37℃24h培养后所生长的菌落数。一般规定，1mL自来水的总菌数不得超过100个。
3. 大肠菌群是一群需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，其在37℃培养24~28h能发酵乳糖产酸产气。它们普遍存在于肠道中，且具有数量多，与多数肠道病原菌存活期相近，易于培养和观察等特点。大肠菌群数是指每升水中含有的大肠菌群的近似值。大肠菌群的检测方法有多管发酵法和滤膜法两种。本实验采用多管发酵法，它被称为水的标准分析法，即将一定量的样品接种乳糖发酵管，根据发酵反应的结果，确证大肠菌群的阳性管数后在检索表中查出大肠菌群的近似值。我国规定：每升自来水中大肠菌群数不得超过3个。
三、仪器与试剂：
仪器：细菌培养皿（6副）；试管（10支）；小支管（10个）；试管架；移液管（2ml x 2 个）；三角瓶；试管塞；接种环；载玻片+盖玻片；玻璃棒；旧报纸；麻绳；pH试纸；酒精灯；托盘天平；显微镜；浮游生物网；采水器；塞氏圆盘；电热干燥箱；手提式灭菌锅；37°C培养箱等。
试剂：牛肉膏蛋白胨培养基，乳糖蛋白胨培养基，伊红美蓝琼脂培养基；草酸铵结晶紫染色液；革兰氏碘液；95％乙醇 ；番红(沙黄)染色液
四、实验内容及步骤：
1. 玻璃器皿的准备：
1) 取6副培养皿，2支移液管（一支1ml，一支10ml）。将培养皿洗净晾干，顺序排列，
用报纸包好；将两支移液管洗净晾干，用棉花塞住移液管末端，长约1cm，将其分别包装好。将包装好的培养皿和移液管进行干热灭菌（160~170℃，2h）。
2) 取一个锥形瓶，10支试管，洗净晾干。取5支试管，分别加入9ml自来水，盖上铝塞；
取250ml锥形瓶，加入100ml已配置好的培养基，再加入2g琼脂，静置，塞上棉花塞；取另5支试管，分别取5ml 3倍浓缩初发酵培养基，先将小试管加满，并将剩余培养基加入试管中，再将小试管倒置划入试管底部，盖上试管盖，重复操作于剩余4支试管。 3) 将10支试管归拢，用报纸将试管上方盖没，用细绳于试管盖稍下方处将10支试管扎紧；
用报纸已同样方法将锥形瓶顶部包装，以细绳扎紧。将10支试管与锥形瓶一同进行湿热灭菌（121.5℃，20min）。
2. 培养基的配置：
1） 原理：培养异养细菌最常用的培养基是牛肉膏蛋白胨培养基（普通培养基）。培养基的种类很多，根据营养物质的来源不同，可分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基等。多数培养基配制是采用一部分天然有机物作碳源、氮源和生长因子的来源，再适当加入一些化学药品，就叫半合成培养基，其特点是使用含有丰富营养的天然物质，再补充适量的无机盐。配制十分方便，能充分满足微生物的营养需要，大多数微生物都能在此培养基上生长。本实验配制的培养基就属此。
2） 取5支试管，用10mL的移液管各加入9mL自来水，盖上试管塞。用烧杯从冰箱里取一部分乳糖蛋白胨培养基单倍浓缩液和三倍浓缩液，取10支试管，用10mL移液管移取10mL单倍浓缩液，先将小支管装满后，再将剩余的液体放入试管中，小支管液一并放到试管中，小支管中不能有气泡，盖上试管塞。再取5支试管，用5mL移液管移取5mL三倍浓缩液，先将小支管装满后，再将剩余的液体放入试管中，小支管液一并放到试管中，小支管中不能有气泡，盖上试管塞。用100mL移液管移取100mL固体培养基放入三角瓶中，用天平测出2g的琼脂，放到三角瓶中，用电炉加热，同时，用玻璃棒不停搅拌，使琼脂溶解。
3. 水样采集：
1） 采水器：使用时注意先夹住出水口橡皮管,再将两个半圆形上盖打开。让采水器沉入水中,底部入水口则自动开启。下沉深度应在系绳上有所标记,当沉入所需深度时,即上提系绳,上盖和下入水口自动关闭,提出水面后,不要碰及下底,以免水样泻漏。将出水口橡皮管伸入烧杯口,松开铁夹,水样即注入烧杯。
2） 浮游生物网：先将开关关闭，在水面下至少10cm的位置，来回摆动几次，取离水面，打开开关，将取出的水样倒入小烧杯中。
3） 透明度：准备一个透明度盘，再在透明度盘上面系上一根长绳子，并在绳子上做好长度标记。然后就可以把圆盘小心地放入水中，并让它缓慢地向下沉，千万要注意保持圆盘与水面平行。始终注意观察沉入水中的透明度盘，当它刚好看不见时，记下圆盘在水中的深度，这就是河水的透明度。
4） pH：用玻璃棒蘸取少量水样于试纸上，半分钟后与标准比色卡对比，读出pH值。
4. 浮游生物的镜检：
在制片前先将盖玻片、载玻片擦净，用移液管吸取水样，滴一滴于载玻片上，然后用镊子将盖破片沿着水珠的边缘慢慢放下，若发现标本液溢出或盖玻片内有气泡时，应将标本液吸回到器皿中，重新制片，直至水滴恰好在盖玻片内，并无气泡出现为止。将做好的片子置于载物台上，用物镜的低倍、中倍、高倍依次检查。仔细观察并对照书本上的图片，记录所看到的浮游生物种类和数量，遇到书上没有的浮游生物，则将它画下来。
5. 细菌总数：
1） 菌种分离方法（连续稀释分离法）：取出一支2mL的无菌移液管；保持在离火焰2~3cm处，用移液管吸取水样1mL，放入盛有9mL自来水的试管1中，移液管插入试管1中来回
吹吸三次，进一步将水样分散、混匀。再从试管1中吸取1mL液体放入盛有9mL自来水
的试管2中，并混合均匀，重复操作3次。试管4中水样浓度稀释到104，试管,5中水样
—
浓度稀释到105。15支一组，放进37°C恒温箱培养24h。
—
2） 稀释平板计数法：
a.取样：用三支1ml无菌吸管分别吸取10-3、10-4、和10-5的稀释菌悬液各1ml，对号放入编好号的无菌平板中，每个平板放0.2ml。 不要用1ml吸管每次只靠吸管尖部吸0.2ml稀释菌液放入平板中，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。
b.倒平板 ：尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平板中倒人融化后冷却至45℃左右的培养基约15毫升／平板，置水平位置迅速旋动平板，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平板或溅到平板盖上。待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。
6. 大肠菌落：
1） 大肠菌落初发酵：于各装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入10mL水样；于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL水样；再于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入0.1mL水样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养24h。 2). 革兰氏染色法：
a．涂片 在洁净的载玻片中央滴1滴蒸馏水，用烧灼冷却过的接种环取少量菌体至玻片水滴中，混和均匀后涂成薄片，面积不宜过大。
b．固定 在空气中自然干燥，使菌体的位置不再移动(也可将玻片置酒精灯火焰高处稍稍加热以干燥之，涂抹面应向上)。于酒精灯火焰中通过3～4次(以玻片与手接触面感到稍微烫手为度)，使菌体固定于玻片上而不易脱落。固定也可使标本容易着色。
c．初染 放标本于水平位置，在上面滴加草酸铵结晶紫染色液。染色时间1min.染色达到需要的时间后，倾去染色液，并以水冲洗，至冲下的水无色时为止。
d．媒染 滴加革兰氏碘液，染1~2min，水洗。
e．脱色 滴加95％酒精脱色，将酒精滴至涂片上，静置约45s后水洗。 f．镜检 油镜镜检
3） 显微镜油镜镜检：将聚光镜提升至最高点，转动转换器，移开高倍镜，使高倍镜和油
镜成“八”字形，在标本中央滴一小滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，微微转动细调节器，可见清晰物像，如果油镜上升已离开油面还未看清物像的话。需重新调节。此时可从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接。应特别注意不能压在标本上，更不能用力过猛否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。用左手向上转动粗调节器，当视野中有模糊的标本物像时改用细调节器，直到看清物象为止。
五．实验结果与分析：
1. 浮游生物
藻类 ++ 未知浮游生物 纤毛虫 + + 线虫 + 水蚤 ++
盘星藻 + + + 丝藻 + + + +
2. 细菌总数 不同稀释度的平均菌落数 次数 1 10-4 15 10-5 14 对照 5 2 18 10 6 3 17 12 6 1.4 355000 3.55*10^5 两个稀释度菌落数之比 细菌总数 报告方式 （CFU/ml） （CFU/ml） 3.大肠菌群
4.结论
根据实测结果：校园河水pH=6.5,透明度=85.20cm=0.852m
《地表水环境质量标准》
pH 透明度/m 15 4 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 6～9 2.5 1.5 0.5 Ⅳ Ⅴ
《水质评价标准》 水质评价 极清洁水 清洁水 不太清洁水 细菌总数/ml 10-100个 100-1000个 1000-10000个 不清洁水 极不清洁水 10000-100000个 多于100000个
由以上数据可得出结论：
根据地表水标准，苏州科技学院石湖校区河水属Ⅳ类～Ⅴ类地表水。
根据细菌总数测定值以及水质评价标准，该河水为极不清洁水,已被严重污染,应立刻治理。
六．个人感想与总结：
通过此次微生物实验-校园河水中的生物检测与水体水质评述,让我对微生物这门课程以及实验探索产生了十分浓厚的兴趣。老师给我们介绍了我们本学期微生物实验的几个实验和报告的要求，也让我们了解了微生物实验和以往其他实验的不同。实验步骤虽然很简单，但是往往一个微小的细节处理不当也会导致你整个实验结果的失败。这个我真的深有体会，实验步骤说难也不难，先配置培养基，对洗干净的试管、培养皿以及配置好的培养液进行灭菌，等灭菌完进行接种，观察细菌总数和大肠菌落。然而这一步步操作却需要我们拥有严谨的实验精神，而不能粗心大意或是急于求成。实验让我们真正的将书本上学到的知识运用到实践生活中去，让我们锻炼了独立思考和动手操作的能力，学以致用，受益匪浅。
校园河水中的生物检测与水体水质评述 实验报告
