一、名词解释(20’)
引物、克隆、探针、转化率、重组率、基因工程、分子克隆技术、限制性核酸内切酶
1、基因工程
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 2、基因表达
是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子
3、限制性核酸内切酶
能特异性识别双链DNA某段特殊序列，并切割DNA双链的酶，主要存在于原核细菌中，主要作用是保护自身DNA不受限制，及破坏外源DNA使之迅速降解 4、重组率：重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数
在常规实验条件下，重组率一般为25-75%；重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作 5、探针
一小段单链DNA或RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列，双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素(P-32常用)、荧光燃料或酶标记成为探针 1 U DNA连接酶的酶活性
在最佳反应条件下15 ℃反应1h，完全连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量
二、选择题
1、重组乙肝疫苗是
由重组酵母或重组CHO工程细胞表达的乙型肝炎表面抗原，经纯化、灭活及加入佐剂吸附制成。前者为重组酵母乙型肝炎疫苗，后者为重组CHO乙型肝炎疫苗 2、基因工程用于药物筛选模型的战略
3、控制质粒拷贝数的意义是使外源蛋白在细胞内更稳定 4、酵母作为受体，比大肠杆菌的优势在于 大肠：原核
酵母：真核，具有多种细胞器，在用于生产需加工分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势 5、分子杂交的化学本质是形成氢键 6、PCR定点突变DNA的方法是 碱基的添加、删除、点突变
7、双链DNA切开后，两链末端基团是5'-磷酸基和3'-羟基的末端『五菱三枪』 8、限制性核酸内切酶缓冲液中，DTT的功能是
还原，抗氧化。保护酶分子上的还原性基团，维持还原性环境，稳定酶活 9、DNA连接反应的最佳温度是 16℃
10、聚乙二醇促进平头DNA分子连接的机理： 促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率 11、大肠杆菌DNA聚合酶的用途：
细胞复制DNA的重要作用酶，催化DNA合成
Klenow酶：又称Klenow片段，用枯草杆菌蛋白酶将DNA聚合酶I裂解为36kD和76kD
两个片段，大片段称为Klenow片段 12、T4-DNA聚合酶的用途是 ① 它无5'→3' 外切酶活性
② 它需一条有引物的单链DNA作模板
它利用单链DNA为模板进，可同时利用它作为引物，即此单链DNA的3'端能环绕其本身的某一顺序形成氢键配对，3'端的未杂交部分即被T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性切去，然后在其作用下从3'-OH端开始聚合，合成该模板DNA的互补链，再以互补链为模板合成原来的单链DNA。
13、碱性磷酸单酯酶的用途是切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端 14、质粒是一种
附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。
15、转化子扩增的主要目的是____
增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序 扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选 表达外源基因，便于筛选和鉴定
16、PIJ质粒含有tsr，me’，外源DNA应克隆于 Tsr？
17、DNA重组中，筛选的任务是，转化扩增后，____ 获得大量目的基因拷贝
18、puc18上，lac z编码产物可让无色X-gal变成蓝色 19、限制性酶切图谱法可用于区分重组子与非重组子
21、菌落原位杂交、克隆菌的裂解与重组DNA分子的变性是由于____而引起的
22、放射免疫原位杂交法快速筛选目的重组子的工作原理是特异性检测目的基因表达的____
23、鸟枪法首先能识别切割_____序列的酶部分消化染色体DNA 24、伯格霉素最好选用____受体 胞膜受体 胞浆受体 胞核受体
25、cDNA第一链合成过程叫____，cDNA差向分离中要涉及____ 退火
26、PCR反应的必要条件是____ 温度、时间、循环次数
反应体系应加入模板DNA、Taq 酶、一对引物、dNTP或缓冲液
27、很多大肠杆菌中表达的人蛋白编码基因为何多用人工合成？工作量更小 28、载体一般具有在受体细胞中____
至少有一个复制起点、有克隆位点、具备转化的功能、遗传标记基因、具有较高的载装能力 29、有T7启动子的载体需要大肠杆菌的BL21株 30、细胞分离质粒纯度最高的程序是____ 梯度离心？
31、体外包装的重组λ噬菌体转染大肠杆菌时，为何加麦芽糖？大肠杆菌大量繁殖 32、插入型λDNA的特点是____
33、λDNA为何一般不用于表达目的基因？
不宜作为基因工程载体，原因是：(1)分子量大，(2)酶的多切点，(3)无选择标记 34、M13噬菌体DNA载体的特征是____
35、考斯质粒上，cos区功能是____ 识别噬菌体外壳蛋白
36、Ap’与lacZ+，受体基因的遗传表型应为____ 37、同黏性末端，外源DNA片段的极性
38、BamHI与BgIII互为同尾酶，若外源DNA片段两端均为BamHI末端，而载体用BgIII切开，则：
39、NarI(5’-GG’CGCC-3’)切开的DNA用Klenow处理，另一段经HgiAI(5’-GTGCA’C-3’)切开的用T4处理，则连接点的序列为：
40、两侧均为SphI(5’-GCATG’C-3’)切开的DNA，需克隆在某载体的PstI(5’-CTGCA’G-3’)位点上，为了避免平头连接，且希望用SphI从重组分子中回收插入片段，则SphI切开末端可增补：
41、将载体上某酶识别序列换成另一个酶的识别序列，需：基因定点突变 42、重组DNA中，转化操作单元指的是
其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。 43、重组λ-DNA转染大肠杆菌的实验流程是：
44、Ca2+诱导吸附完整的细胞转化，一般采用：CaCl2
45、原生质体转化程序适用于：A. 大肠杆菌 B. 链霉菌 C. 酵母 46、电穿孔转化法的特点是
将待转化的质粒或DNA重组连接液滴加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。
电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。
同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验。 47、转化率3×106/μgDNA的含义是：
每微克pUC18(pUC18是适合于双脱氧法DNA测序的载体，通常运用于重组dna的分子克隆中)中只有3×106个分子能进入受体细胞，一微克pUC18共有3.4×1011个分子（6.02×1017 / 2686×660），即每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞。
48、2ngPUC18转化大肠杆菌JM83菌株，涂布10块平板，得到了500个菌落，求转化率： pUC18：适合于双脱氧法DNA测序的载体
49、pET24纯质粒转化大肠杆菌JM83菌株，转化率为5×105/μgDNA，则同条件下，转化pET24与外源DNA片段连接液的转化率为：
三、分析解答
1、基因工程技术使得外源基因高效表达的原理是？(10’)
基因工程中基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。
外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。 提高DNA与载体重组率的方法是？(10’)
①连接反应条件 外源片段：载体＝ 2:1-10:1（分子数），增加碰撞机会，减少自身环化 ②载体除磷 （磷酸酯酶5’除磷）
③TdT在3’端增加人工粘性末端，防止载体自我环化 Ⅰ 加大外源DNA与载体的分子之比 Ⅱ 载体分子除磷
2、苍蝇体内有多种有效抗菌多肽，设计分离克隆该多肽编码基因的实验方案？(10’) 构建cDNA文库，然后克隆，选择对抗菌肽敏感的指示菌涂布在固体培养基上 凡克隆周围出现透明圈的就是抗菌肽的目的基因
类比：某实验室欲从链霉菌中分离克隆一种新型抗生素的抗性基因，试设计实验方案。
基因工程概论期末考试
