mmu-miR-3475-3P在心脏发育中的生物信息学分析

mmu-miR-3475-3P在心脏发育中的生物信息学分析*

沈 兴1，2，潘 博1，周挥铭1，刘玲娟1，田 杰1

【摘 要】[摘要] 目的 探讨mmu--miR-3475-3P可能参与的生物学过程及信号通路。方法 用实时荧光定量PCR方法测定mmu-miR-3475-3P在小鼠胚胎心脏和成熟心脏中的表达。再综合应用TargetScan、miRDB、miRanda等常用microRNA在线数据库对miR3475-3p进行靶基因预测，对所得靶基因进行基因功能注释(Go)和信号通路分析。结果 mmu-miR-3475-3P在小鼠胚胎心脏和成熟心脏中存在明显的表达差异，运用TargetScan、miRDB、miRanda对miR3475-3P进行生物信息学分析发现该microRNA可能调控441个靶基因。结论 mmu-miR-3475-3P在小鼠胚胎心脏高表达，其预测的靶基因富集于多个信号通路及细胞生物学过程。 【期刊名称】重庆医学 【年(卷),期】2017(046)026 【总页数】3

【关键词】[关键词] mmu-miR-3475-3P；生物信息学；靶基因；心脏发育 ·生物信息学·

目前，心脏疾病的发病率逐年上升，已成为威胁人类健康的主要疾病之一[1]。对正常心脏发育过程的深入解析可为实现对心脏疾病的早期防治提供理论依据。心脏的构建涉及多细胞、多基因，也受到遗传与环境因素的共同影响。表观遗传作为遗传与环境因素之间的桥梁在胚胎心脏发育过程中具有重要作用，特别是表观遗传中的microRNA被认为广泛参与了心脏的发育及疾病的发生、发展[2-5]。mmu-miR-3475-3P是本课题组在前期研究中发现的在胎鼠心肌中高

表达的microRNA，目前对其的研究较少。本研究拟通过生物信息学分析，预测mmu-miR-3475-3P的关键靶基因和涉及的信号通道，为进一步行mmu-miR-3475-3P在心脏发育中的功能、机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物采用清洁级昆明孕鼠，购于重庆医科大学实验动物中心[合格证号：SYXK(渝)2007-0016]。实验用引物均购自广州市锐博生物科技有限公司，RNA酶抑制剂购自美国Thermo Scientific公司，脱氧核糖核苷三磷酸购自Tiangen公司，绿色荧光染料购自美国Bio-Rad公司。 1.2 方法

1.2.1 mmu-miR-3475-3P表达量在胚胎鼠和成年鼠心脏中的检测 以胚胎14.5 d的昆明小鼠(n=3)和生后21 d的成年昆明小鼠(n=3)为对象，用Trizol试剂提取总RNA，并利用紫外分光光度计K5500在OD260/280,OD260/230波长下进行RNA质检，以该RNA作为模板，以1 μg总RNA反转录成CDNA第1链，并以其为模板进行PCR扩增，根据小鼠mmu-miR-3475-3P(MIMAT0015219)的编码序列5′-UCU GGA GGC ACA UGG UUU GAA-3′设计合成PCR引物，按如下条件进行PCR反应：95 ℃ 20 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、70 ℃ 1 s，共40个循环，绘制溶解曲线。以U6作为反应内参，microRNA的含量通过2-△△ct法定量计算。

1.2.2 mmu-miR-3475-3P生物信息学分析 综合应用TargetScan、miRDB、miRanda等常用microRNA在线数据库对mmu-miR3475-3p进行靶基因预测。对所得靶基因进行基因功能注释(gene ontology，Go)(http://www.geneontology.org/)，并建立起统计模型，分析整个基因组

中最显著的功能，计算这些基因在某(多)个特定的分支的超几何关系，根据基因的GO 注释，选择本物种的所有基因作为背景基因，用超几何分布计算P值，以P<0.05为显著性阈值分别得到相对于背景具有统计意义的高频率注释，从而得到基因集合在GO类别上的分布信息和显著性情况。将mmu-miR3475-3p的预测靶基因进行基于Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG，http://www.genome.jp/)的生物学通路数据分析，通过Fisher Exact Test计算P值，以P<0.05为显著性阈值得到基因集合相对于背景具有统计意义的信号转导及疾病通路。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量资料用表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 mmu-miR-3475-3P在胚胎小鼠和成年小鼠心肌中的表达量分析 mmu-miR-3475-3P在胎鼠14.5 d的心肌中的表达量明显高于成年鼠心肌中的表达量，在胎鼠中的表达量为17.41±5.74，在成年鼠心肌中的表达量为1.00±0.54，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 mmu-miR-3475-3P生物信息学分析 运用TargetScan、miRDB、miRanda对mmu-miR-3475-3P进行靶基因预测分别获得3 797、518、8 431个靶基因，设3个数据库中共同预测的靶基因为候选基因，共441个(图1)。针对靶基因的GO分析提示mmu-miR-3475-3P涉及多种生物学过程(图2)，其中多个基因涉及心脏、血管发育、跨膜离子通道转运等(表1)。利用KEGG经典生物通路数据库对mmu-miR-3475-3P的靶基因进行信号通路富集分析，结果提示441个靶基因参与广泛的信号转导通路，包括代谢通路、内