ＳＭCＣ是一类含有N－羟基琥珀酰亚胺（ＮHS)活性酯和马来酰亚胺的双功能偶联剂.可以将分别含有巯基和氨基的化合物键接在一起。NHＳ活性酯与伯胺在PH7—9的环境形成酰胺键。马来酰胺与巯基在PH6.5—7。5的环境下形成稳定的硫醚键。在水溶液中，NHＳ活性酯的水解是(与氨基的反应)个竞争反应。马来酰胺比NＨS稳定,但是在PＨ大于7。5时，马来酰胺会慢慢水解,失去与巯基反应的特异性。因而，在使用SMＣC时通常是在ＰＨ7.2—7.5的环境下进行，并且先让ＮHＳ发生反应。 SMＣＣ结构里的环己烷环可以降低马来酰胺的水解速率．这使得蛋白质在用SMCC修饰之后可以冻干存放一段时间。很多蛋白质都选用该试剂来进行马来酰亚胺修饰.
用SMＣC来制备抗体-酶或者半抗原作载体的蛋白质,经常采用两步合成法．首先，含有氨基的蛋白质与几倍的偶联剂反应,反应结束后通过脱盐柱或者透析的方法除掉没有反应玩的ＳＭCC。然后,再与含有巯基的蛋白质反应。在实际操作中要注意的是,SＭCＣ怕潮湿，存放时要和干燥剂一起存放．并且使用中从冰箱拿出来时要先在室外放置一段时间平衡温度,以免立刻开启,空气中水分遇冷凝结，破坏SMCＣ结构。
IＮＳＴRUCＴＩONS
SMCC (ｓuｃciｎｉmidyｌ ４－[Ｎ-maｌｅimidomeｔhｙl]cycｌoｈexane－1—cａrboxylaｔe）， 50 mｇ
Mｏｌeculａr Ｗeigｈt: 334。32 Ｓpａcer Arm： 8。3 ? Nｅt Ｍaｓs Addeｄ: ２19．09
Stoｒａge: Ｕpｏn recｅipt ｓｔｏre desｉｃcatｅd at 4° C. Pｒｏduｃt iｓ ｓhipｐed aｔ amｂient ｔemｐeratｕre。
Sulｆo—SMCC (sｕlｆosucciｎimidyl 4—[N—ｍaleｉｍidometｈyｌ]cyｃlohｅｘａｎe-1—cａrｂoｘylate）, １ ｇ Sulｆo—ＳＭCＣ, 5０ mｇ
Sｕlｆｏ-SＭCC, Ｎo-Weiｇh? Foｒmaｔ, 8 × 2 mｇ mｉcｒｏtubes Molecular Weｉght: 43６．3７ Spacｅr Aｒm: ８。3 ? Neｔ Mass Added: 21９．09 CＡＳ #: 9２9２1-2４-9
Sｔｏrａgｅ: Ｕpｏn ｒeceipt stoｒe desｉcｃateｄ ａt —20° C. Product is ｓhiｐped at ambｉeｎt temperature。
Ｉｎtｒoｄｕｃtioｎ
SＭCC aｎd iｔs ｗater-soｌuble ａｎａlｏｇ Ｓｕｌｆo-ＳMCC are hｅtｅrobｉｆｕnctｉonaｌ crosslinkｅｒs ｔhat coｎtaｉn N—hyｄroxysuccinｉmide (NHS） esteｒ anｄ malｅｉmide gｒoups that ａｌlｏw covaleｎt conjugatiｏn oｆ amｉne— and ｓulfhydｒｙl-conｔａｉniｎg mｏlecules。 ＮHS ｅsterｓ reacｔ with priｍary amｉｎes aｔ ｐＨ 7－9 to fｏrm amidｅ boｎds, ｗhiｌe mａleiｍideｓ ｒeact with sulfｈyｄryl gｒoups ａt ｐＨ ６。5—７.5 ｔｏ fｏrｍ sｔable thioeｔhｅr ｂonds。 Iｎ ａqueous ｓoｌｕtiｏnｓ, NHS esteｒ hydrolｙtic deｇradatｉon is ａ coｍpetｉng reactiｏn ｗhosｅ ｒaｔe inｃreaseｓ wｉth pＨ。 The maleｉmide gｒouｐ is more sｔable ｔhan tｈe NＨＳ－esｔeｒ grｏｕｐ bｕt wilｌ ｓlowｌy hydrolyze ａnd loseｓ ｉｔs reacｔion ｓpeciｆiｃiｔy fｏr suｌfｈｙdryｌｓ at ｐH valｕeｓ 〉 7。５. Foｒ tｈese ｒeasoｎs， conjｕgａtｉons with thesｅ croｓsliｎkｅrｓ ａｒｅ usuallｙ perfoｒmeｄ ａt pH ７。2—7．５， ｗｉth the NHＳ-esteｒ (aｍｉne—targeteｄ） ｒeａctｅd beｆore ｏr simultanｅous ｗith thｅ ｍaleiｍide （ｓｕlｆhydryｌ—tarｇetｅd) ｒeaｃｔion.
Ｔｈｅ cｙcloｈexａne rｉｎg in the ｓpacer arｍ of ｔhese rｅagｅnts dｅcrｅａsｅs thｅ rate oｆ ｈydrolyｓｉｓ of the maleimide grｏup ｃomｐared tｏ similar reａｇents ｔhat dｏ not ｃontａin thiｓ ring.1 This featuｒe ｅｎables prｏteiｎｓ tｈat hａｖe bｅen ｍalｅimide－aｃtivａtｅd witｈ SＭCC or Ｓｕlfo—ＳMCC to be lyoｐｈilｉｚｅd and sｔoｒeｄ for lａteｒ coｎjugation ｔo a sulｆhydryl—contａiｎiｎg mｏleｃule。 Many mａleiｍｉde－ａctiｖaｔed proｔein pｒｏdｕcts arｅ pｒoduced iｎ tｈiｓ ｍａnｎｅｒ (see Relatｅd Produｃtｓ)。
SMCC aｎd Suｌfo-ＳMCＣ arｅ often used to prｅparｅ antibｏdy-enｚｙmｅ aｎd haptｅｎ—ｃarｒier pｒoｔeiｎ ｃonｊｕｇates in a tｗｏ—ｓtｅｐ ｒeaｃtion scｈeｍe。 First， the ａmine—containing proｔein is ｒeacted ｗith a sｅveral—ｆold ｍolar excess oｆ ｔhe cｒｏssliｎkeｒ, folloｗｅｄ bｙ reｍｏvａl of excess （nonreaｃtｅｄ) reａｇent by dｅsalｔing or diａlyｓis； ｆinallｙ， the suｌfhydrｙｌ—coｎtａiｎiｎｇ molecule is added ｔo reaｃt with thｅ maleｉmidｅ ｇrｏｕps alｒeａｄy attaｃhed to the firｓt protein。
Suｌfo—SMＣC is sｏluｂle in ｗaｔer anｄ many oｔｈｅr ａqｕｅoｕs buffers ｔo aｐｐroxｉmａｔely 10 mM, ａlthough soluｂilｉty dｅcreａses ｗitｈ ｉncreasing salｔ cｏｎcentｒatioｎ。 SMCC ｉs noｔ ｄｉrectly water—soｌuble and must be dissolｖｅd iｎ ａｎ oｒgａnic solveｎt sｕｃh aｓ dimｅｔｈylsuｌｆoxide （ＤMSO) ｏr diｍethylforｍaｍide (DMＦ); ｓubseｑｕeｎt diluｔiｏn ｉnto aｑueouｓ rｅａctｉoｎ buｆfer ｉs ｇeｎeｒally possible， and moｓｔ proｔein ｒeacｔants wilｌ remaｉｎ soluble if the ｆｉnal coｎｃentｒation ｏf ｏｒganic solveｎt is ｌess than １０%。
SMCＣ ａnd Sulfo—SMCC
Imｐortant Prｏdｕct Ｉnfoｒｍatｉon ?
SＭCC ａnd Ｓulfｏ—SMCＣ arｅ mｏisｔｕre-sｅnsitｉvｅ。 Stoｒe rｅａgenｔ ｖial in desiｃcaｎt. Equilｉbrate vｉａl to rooｍ temｐｅratuｒｅ ｂefore openｉng to avoiｄ moｉｓｔure ｃoｎdenｓation ｉnｓｉｄe tｈe ｃontainｅr。 Dissolvｅ nｅｅded aｍount of reaｇeｎt aｎｄ ｕse ｉt immeｄｉateｌy beforｅ ｈｙdｒolysis ｏcｃｕrs. Discaｒd any unuseｄ reconstｉtｕted reagｅnt. Do ｎot sｔore rｅaｇｅnｔ in soｌuｔion. ?
No-Weｉｇh Miｃｒotuｂe Handling: Ｉｍmｅｄｉａteｌｙ ｂefore usｅ, puncｔuｒe ｔhe micｒｏtｕｂe ｆoil ｗith a pｉｐｅtte tｉｐ， add 20０ μl ｏｆ 50 mＭ sodｉｕm ｐｈosphａte bｕffer （ｐH 7．0-7。5) oｒ ultraｐure ｗateｒ and ｐiｐｅｔte ｕp and doｗｎ to mｉｘ。 Afteｒ usｅ, cut the used ｍicrotube from tｈe microtubｅ striｐ and discaｒd。 Stｏre ｔhe uｎｕsｅｄ microtｕbeｓ in the ｆｏil poucｈ provｉdeｄ。
Nｏte: Dｏ noｔ use ｐｈｏｓphaｔe—bｕffｅred saｌinｅ (PＢS） ｆor initiaｌ diｓsolｕtｉon of Sulｆo—ＳMCＣ; ｔhe rｅagent dｏｅs not ｄｉssｏｌvｅ welｌ ｉn bｕfferｓ ｅｘｃeｅdｉng 50 mＭ ｔotal ｓalts. Howeｖeｒ, oｎcｅ disｓｏlveｄ， thｅ ｓolutｉon caｎ bｅ ｆuｒther dilutｅd in PＢS ｏｒ oｔher non—amｉne buffers。 ?
Aｖoｉd bｕfｆers conｔainｉｎｇ prｉmａry ａmines （e。g。, Ｔris or ｇlycｉne) ａｎd sｕlｆｈydｒylｓ during conｊuｇａｔion, because tｈｅｙ will coｍｐｅtｅ ｗiｔｈ the inｔeｎded reaｃtioｎ. If ｎecｅssaｒy， ｄialyze or desalt sａmｐles into ａn aｐpｒopriaｔe buffer ｓｕch as phｏｓphatｅ— ｂuffered salｉne （PBS）．
?
Moｌeｃuｌes to bｅ reacted ｗiｔh tｈe maleｉｍidｅ ｍoieｔy ｍｕst hａve fｒeｅ (reduced） ｓulｆｈydryｌｓ． Ｒeducｅ ｐeｐtiｄe disｕlfide ｂonds wｉth Imｍobilized TCEＰ Ｄisuｌfide Reduｃing Gel (Product Nｏ. ７77１2）。 Fｏr ｐroteｉｎｓ, reｄuce ｄisulｆｉdｅ ｂonｄｓ uｓing 5 mＭ TCＥP （1：100 dilutｉｏｎ of Bond—Bｒeakｅr? ＴCＥP Solｕtioｎ， Ｐｒoduct No． 7７7２0) fｏr 30 ｍinuｔes at ｒoｏｍ teｍperａtuｒe,
followeｄ ｂy twｏ ｐaｓses ｔhｒｏuｇh a ｓuｉtａｂｌｅ dｅsaｌtinｇ ｃolumｎ (e。g。， Zeｂa? Deｓaｌｔ Spin Columns)。 Ｂｅ aｗare ｔhat proteins (ｅ。g。, aｎtｉｂoｄｉes） ｍay be inacｔivatｅd bｙ compｌete redｕcｔｉon oｆ ｔheir ｄｉsuｌｆiｄｅ bonds。 Ｓeｌecｔiｖe reduｃtiｏn oｆ hｉnｇe—regioｎ disulfｉde bonｄs ｉn IgＧ ｃan bｅ accomｐｌｉｓhed with 2-Mｅrcａｐtoethylaminｅ?HＣl (２-MＥA, Ｐroduｃt No. 20４08)。 Ｓuｌfhyｄryls can be aｄdｅd to ｍoｌeｃules using N—suｃcinimｉｄｙl S-ａｃetｙlthｉoacetate （ＳＡTA， Prｏｄuct Ｎｏ. 2６１０２) ｏr 2—iminｏthｉolaｎe?H
SMCC-结构反应解释【可编辑范本】
