新城疫诊断

新城疫诊断

新城疫（newcastle disease,ND）是由新城疫病毒引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病。OIE将其列为A类疫病。

想要了解新城疫首先要知道什么是新城疫病毒：新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒属(Paramyxovirus)中的一个种。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。弱毒株仅引起鸡群呼吸道感染和产蛋量下降，但可迅速康复。人类可因接触病禽和活毒疫苗而引起结膜炎或淋巴腺炎，但很快便康复。

新城疫病毒有以下特征：新城疫病毒是ssRNA病毒，有包膜。病毒颗粒具多形性，有圆形、椭圆形和长杆状等。成熟的病毒粒子直径100～400nm。包膜为双层结构膜，由宿主细胞外膜的脂类与病毒糖蛋白结合衍生而来。包膜表面有长12～15nm的刺突，具有血凝素、神经氨酸酶和溶血素。病毒的中心是ssRNA分子与附在其上的蛋白质衣壳粒，缠绕成螺旋对称的核衣壳，直径约18nm。成熟的病毒是以出芽方式释放至细胞外。给新城疫诊断带来困难。

新城疫病毒对外界环境的抵抗力较强，55℃作用45min和直射阳光下作用30min才被灭活。病毒在4℃中存放几周，在-20℃中存放几个月或在-70℃中存放几年，其感染力均不受影响。在新城疫暴发后8周之内，仍可在鸡舍、蛋巢、蛋壳和羽毛中分离到病毒。

病毒对乙醚敏感。大多数去污剂能将它迅速灭活。氢氧化钠等碱性物质对它的消毒效果不稳定。3%～5%来苏尔、酚和甲酚5min内可将裸露的病毒粒子灭活。在37℃的孵卵器内，用0.1%福尔马林熏蒸6h便可把它灭活。

新城疫病毒的所有毒株都能凝集多种禽类和哺乳类动物的红细胞。大多数毒株能凝集公牛和绵羊的红细胞。在病毒的血凝试验中，鸡的红细胞最为常用。

该病毒可在9～12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜上和尿囊腔中培养，大多数毒株也可在兔、猪、犊牛和猴的肾细胞以及鸡组织细胞等继代或传代细胞中培养。鸡胚的成纤维细胞、鸡胚和仓鼠的肾细胞常用于新城疫病毒的培养。

肉鸡新城疫诊断 蛋鸡新城疫诊断

肉鸡蛋鸡新城疫诊断 目前，可根据典型临床症状和病理变化对新城疫做出初步诊断，确诊需进一步做实验室诊断。

[1]临床诊断：

1. 肉鸡蛋鸡精神萎靡，采食减少，呼吸困难，饮水增多。常有“咕噜”声，排黄绿色稀便；

2.发病后部分肉鸡蛋鸡出现转脖、望星、站立不稳或卧地不起等神经症状，多见于发病的雏鸡和育成鸡；

3.产蛋鸡产蛋减少或停产，软皮蛋、褪色蛋、沙壳蛋、畸形蛋增多，卵泡变形、卵泡血管充血、出血。

4. 肉鸡蛋鸡腺胃乳头出血，肠道表现有枣核状紫红色出血、坏死灶。喉头和气管黏膜充血、出血，有粘液；

5. 肉鸡蛋鸡血凝抑制抗体（HI）显著升高或两极分离，离散度增大；

6.注意肉鸡蛋鸡新城疫与禽流感、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、肾传支等的并发和继发感染情况，在诊断和防治鸡新城疫的同时，应特别留意与这些疾病的鉴别诊断与联合防治，特别是联合免疫工作；

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7.应注意非典型新城疫患病鸡群和高免鸡群中由于漏免而存在的易感个体在存储和散播新城疫病毒过程中的作用，重视防治非典型新城疫及避免漏免得情况发生。

实验室诊断：在国际贸易中，尚无指定诊断方法。替代诊断方法为血凝抑制试验。 病原检查：①病毒培养鉴定：样品经处理后，接种9～10日龄SPF鸡胚，37℃孵育4～7天，收集尿囊液做HA试验测定效价，用特异抗血清(鸡抗血清)或I试验判定ND病毒存在。②毒力测定：1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)测定、6周龄鸡静脉内接种致病指数(IVPI)测定、鸡胚平均死亡时间(MDT)测定。

血清学试验：病毒血凝试验(HA)、病毒血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附试验(ELISA，用于现场诊断、流行病学调查和口岸进出境鸡检疫的筛检)。

样品采集：用于病毒分离，可从病死或濒死禽采集脑、肺、脾、肝、心、肾、肠(包括内容物)或口鼻拭子，除肠内容物需单独处理外，上述样品可单独采集或者混合。或从活禽采集气管和泄殖腔拭子，雏禽或珍禽采集拭子易造成损伤，可收集新鲜粪便代替。上述样品立即送实验室处理或于4℃保存待检(不超过4天)或一30℃保存待检。用于血清学试验的样品，一般采集血清。

鸡新城疫诊断预防

(1)、要做好免疫，新城疫的免疫原则如下：

①、及早实施免疫，提前建立局部粘膜抵抗力。

②、活疫苗与灭活苗联合使用。活疫苗免疫后产生免疫应答早，免疫力完全，缺点是产生的体液抗体低且维持时间短。灭活苗免疫能诱导机体产生坚强而持久的体液抗体，但产生免疫应答晚，且不能产生局部粘膜抗体。两种疫苗联合使用可以做到优势互补，给鸡群提供坚强且持久的保护。

③、根据抗体水平，及时补充免疫。当前主要以非典型新城疫发生为主，原因是鸡群抗体不均匀有效，因而监测鸡群的抗体水平非常重要，要保证HI抗体水平育成期不低于6，蛋鸡不低于9。

(2)、建议的免疫程序：

一：1-3日龄，Ⅱ系、IV系或克隆株疫苗; 二：首免后1-2周，VH、IV系或克隆株; 三：二免后2-3周，活苗+灭活苗;

四：8-10周龄，IV系或克隆株气雾或点眼; 五：16-18周龄，活苗+灭活苗;

产蛋期：根据抗体水平及时补免或两个月免疫1次活疫苗。在做好免疫的同时，加强饲养管理，做好消毒工作。蛋鸡新城疫诊断。

存在本病或受本病威胁的地区，预防的关键是对健康鸡进行定期免疫接种。平时应严格执行防疫规定，防止病毒或传染源与易感鸡群接触。

发生本病时应按《动物防疫法》及其有关规定处理。扑杀病禽和同群禽，深埋或焚烧尸体；污染物要无害化处理；对受污染的用具、物品和环境要彻底消毒。对疫区、受威胁区的健康鸡立即紧急接种疫苗。

鸡新城疫诊断预防

①病肉鸡蛋鸡无治疗价值，目前也无法治疗，必须及早淘汰。发病初期，在淘汰病肉鸡蛋鸡的基础上，对其他假定健康肉鸡蛋鸡立即用鸡新城疫Ⅳ系苗进行紧急免疫接种，每肉鸡蛋鸡肌肉注射2头份。注意经常更换注射针头（农村可用多支针头用开水煮过轮流着用）。金蟾毒败每袋拌料100斤。

②平时要重视免疫接种，新城疫的免疫程序，科学的方法是通过HI抗体检测后才能确定。一般来讲，首次免疫在10日龄进行（Ⅳ系苗点眼、滴鼻），经过10～15天后进行二次免疫

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（Ⅳ系苗饮水），若是蛋肉鸡蛋鸡或种肉鸡蛋鸡，于产蛋前2周用新城疫油乳剂苗皮下注射0.2毫升，可获得较有效的免疫力，并含有较高的母源抗体，使该种肉鸡蛋鸡孵出的幼肉鸡蛋鸡，在2周内可获得被动免疫。本病是由新城疫病毒引起的一种急性传染病，肉鸡蛋鸡及禽类均可感染，多在流行后期发生于肉鸡蛋鸡。本病常年可发生，死亡率较高。

最新新城疫诊断技术：

1 病毒分离与鉴定

NDV可以在许多细胞培养系统中增殖，而低毒力的毒株也可在其中一部分细胞中增殖。鸡胚是增殖最敏感、最常用的载体，目前在诊断中广泛使用。用于病毒分离的样品可选择感染鸡的粪便、肠内容物、气管拭子或泄殖腔拭子等，也可根据临床症状采集感染明显的其他组织器官。样品采用常规方法处理后尿囊腔接种9日龄～11日龄鸡胚，收集死亡或濒死胚尿囊液，采用血凝试验(HA)检测尿囊液中是否含有病毒。因流感病毒亦可凝集动物红细胞，故还需用NDV标准阳性血清作血凝抑制试验(HI)，若尿囊液的活性被抑制时，则可确定分离出的病毒为新城疫病毒。另外，NDV也可以用多种细胞培养物分离，最好是鸡胚成纤维细胞或鸡胚肾细胞。但是，有些毒株在细胞培养物中不出现规律的细胞病变，血凝滴度也远比鸡胚低。

病毒分离法是新城疫诊断技术中最为准确的方法之一，但费时、费力，诊断成本较高，不适合作为临床快速诊断方法使用。 2 血清学检测技术

2.1 血凝抑制试验

NDV病毒粒子的囊膜上存在血凝素(HA)，能凝集鸡和多种动物的红细胞，同时病毒进入鸡体后，在鸡的血清中能产生抗红细胞凝集素的抗体，抑制血凝现象，所以可以用HA和HI试验对ND进行定性的检测。HA和HI因具有操作简单、不需特殊的仪器等优点，是目前最常用的方法，大多数的鸡场都用HA和HI试验进行抗体监测和用于ND的诊断。但HA和HI试验在操作中，常会因为各种原因(如不同鸡种的红细胞等)造成误差，并且HI在检测低水平的抗体时不够灵敏而缺乏一定的可靠性。

2.2 琼脂凝胶扩散试验

琼脂凝胶扩散试验(agar gel immunodiffusion，AGID)是一种定性的检测方法，操作简便，不需要特殊设备，且有较好的特异性和检出率，故广泛应用于检测病毒抗原和进行毒性鉴定，以及病毒感染或疫苗免疫后的抗体检测。范昆晓等用灭活的含毒尿囊液制备AGID抗原，方法简单、敏感、不散毒，用所制的AGID抗原检测ND沉淀抗体24 h内即可判定结果。李维义等[3]应用PEG平板进行琼脂扩散试验检测NDV抗原，提高了对新城疫抗原的检出率，采用多器官检查和统一判定的方法，对新城疫的检出率为100%，解决了非典型性新城疫诊断困难的难题，方法简单，准确易行，值得推广应用。

2.3 免疫荧光技术

免疫荧光技术(IFA)就是荧光抗体技术，早在1961年就开始用于人类流感的快速诊断。刘健宏等[4]以NDV单抗荧光抗体标记物(FN29-FITC)为试剂，以直接荧光抗体试验检测各种弱毒株疫苗接种，强毒株人工感染和野外病例鸡组织器官切片的NDV抗原，结果证明具有

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特异性强、灵敏度高、快速、简便等特点。

2.4 乳胶凝集试验

乳胶颗粒具有良好的吸附蛋白等大分子物质的特性，故可用作载体，吸附某种可溶性抗原，检测其相应的抗体，称为乳胶凝集试验(LAT)。邱德新等用硫酸铵沉淀、透析浓缩的鸡NDV抗原致敏乳胶，制成了新城疫病毒乳胶抗原，由此建立了乳胶凝集试验。用所建立的LAT和HI同步检测69份鸡血清，两者的总符合率为94.2%。该法简便、快速、敏感性高、特异性好，且可用于现场检疫，是一种适合基层单位用来检测鸡NDV血清的一种新方法。

2.5 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(ELISA)是应用最广泛的一种免疫测定方法，是以物理方法将抗体或抗原吸附在固相载体上进行的免疫酶测定试验。卢建红等[5]以抗NDV单抗夹心ELISA为基础，建立了PEG-ELISA法，并用于临床NDV的检测。黄仕霞等用鸡红细胞凝集解脱法提纯新NDV抗原用于包被酶标板，最适浓度为0.1 μg/孔～8 μg/孔，灵敏度高于HI，两者具有较好的平行关系。吴保成等以SPF鸡抗细胞培养物纯化毒IgG为第二抗体(1∶200～1∶600)，酶标羊抗兔IgG(1∶500)为指示抗体，建立了检测NDV的间接夹心ELISA，阻断试验表明，夹心ELISA诊断NDV是特异的。于圣青等[6]从10株抗鸡特异性单克隆抗体(McAbs)中筛选出2株McAbs-M22和F23，分别用作包被抗体和酶标抗体而建立的McAbs夹心ELISA试验，对提纯NDV的最小检出量为25 ng/mL，并从临床疑似ND的724只病鸡的口腔棉拭样品中共检出阳性502只，其中200个样品与病毒分离试验结果完全一致。黄小波[7]应用dot-ELISA检测ND血清，有很高的敏感性和特异性。但是，ELISA操作步骤复杂，要求包被的抗原必须有较高的纯度，须采用梯度离心提纯的抗原，同时存在着酶结合物的特异性、阳性结果判定标准的确定等有待解决的问题，但与其他血清学相比，ELISA以其敏感性好、特异性强、操作简便、可重复使用、抗原用量少，同时结果便于长期保存，因此特别适合于基层兽医部门和鸡场对ND的血清学诊断和流行病学普查。

2.6 免疫组化技术

免疫组化技术是以辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记抗体，直接浸染组织标本印片或冰冻切片的免疫检测方法，具有快速、准确等特点。其方法是：常规制备组织切片，滴加鸡抗NDV高免血清，PBS振荡，滴加标记的兔抗鸡抗体，最后滴加底物，水洗，轻染苏木素，常规透视，封片，镜检。马吉飞等[8]应用间接免疫酶组化法诊断鹌鹑ND，在人工感染和自然感染病例的肝、肾、脾、十二指肠中检出NDV抗原，取得满意结果。 3 分子生物学诊断技术

随着 NDV分子结构、分子结构与致病性关系、强弱毒株分子结构差异等的研究进展，为新城疫分子水平上的特异性诊断技术，特别是为从病原体检测角度建立特异性诊断技术奠定了基础。

3.1 RT-PCR技术

RT-PCR技术是一种选择性体外扩增DNA或DNA片段的方法，具有特异、快速、灵敏、简便等优点。目前该方法在NDV检测和诊断中的应用也很广泛。Jestin V[9]首先建立了鉴定

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NDV的RT-PCR方法，以鸡胚来增殖病毒，从感染病毒尿囊液中提取RNA进行RT-PCR，该方法有很高的特异性，能用于NDV的检测和诊断。Angela等[10]报道了采用RT-PCR检测德国最近分离的近200株NDV分离株，结果符合率达90%。RT-PCR方法可以从组织或粪便中直接检测到病毒，无需经鸡胚增殖，并利用PCR产物的酶切分析对野毒株和疫苗进行了鉴别。阎玉河等[12]根据NDV基因结构特点及强、弱毒株F0裂解位点的序列差异设计两对引物，建立了快速诊断ND的RT-PCR技术，该方法具有快速、特异和操作简便等特点，不仅适用于鸡胚的检测，也适用于对病鸡组织匀浆液的检测。黄庚明[13]利用套式RT-PCR检测新城疫病毒核酸，最低检出量为0.3 pg，经核酸杂交验证该法具有很高的特异性和敏感性。谢芝勋等[14]等根据NDV和IBV的基因文库，设计了两对分别与NDV和IBV某段基因互补的引物，用这两对引物对同一样品中NDV和IBV RNA模板进行多重RT-PCR扩增带通过敏感性检测，结果表明该多重RT-PCR最低同时检出10 bp的NDV和100 bp的IBV模板，且克服了一次PCR反应只能诊断一种疾病的缺点，可以从临床样品和环境样品中直接检测到NDV和IBV。王泽霖等[15-16]鉴定新分离毒株的毒力，结果与传统生物学试验完全吻合，但这种方法要求病毒滴度至少在105EID50。唐小飞等[17]根据新城疫病毒基因结构的特点及强、弱毒株融合基因裂解位的序列差异，设计了区别强、弱毒株的两组引物，建立了迅速鉴别NDV强弱毒株的RT-PCR方法，强、弱毒株分别能扩增出442、671 bp的特异性片段和252、671 bp的通用片段。

由此可见，用RT-PCR方法检测病毒具有快速、灵敏、特异、直观等特性，消除了常规血清学诊断方法中非特异性因素的干扰及敏感性问题，可以直观地从分子生物学水平检测到病毒核酸的存在，已成为临床上检测和诊断疾病的一个重要发展方向。

3 分子生物学诊断技术

随着 NDV分子结构、分子结构与致病性关系、强弱毒株分子结构差异等的研究进展，为新城疫分子水平上的特异性诊断技术，特别是为从病原体检测角度建立特异性诊断技术奠定了基础。

3.1 RT-PCR技术

RT-PCR技术是一种选择性体外扩增DNA或DNA片段的方法，具有特异、快速、灵敏、简便等优点。目前该方法在NDV检测和诊断中的应用也很广泛。Jestin V[9]首先建立了鉴定NDV的RT-PCR方法，以鸡胚来增殖病毒，从感染病毒尿囊液中提取RNA进行RT-PCR，该方法有很高的特异性，能用于NDV的检测和诊断。Angela等[10]报道了采用RT-PCR检测德国最近分离的近200株NDV分离株，结果符合率达90%。RT-PCR方法可以从组织或粪便中直接检测到病毒，无需经鸡胚增殖，并利用PCR产物的酶切分析对野毒株和疫苗进行了鉴别。阎玉河等[12]根据NDV基因结构特点及强、弱毒株F0裂解位点的序列差异设计两对引物，建立了快速诊断ND的RT-PCR技术，该方法具有快速、特异和操作简便等特点，不仅适用于鸡胚的检测，也适用于对病鸡组织匀浆液的检测。黄庚明[13]利用套式RT-PCR检测新城疫病毒核酸，最低检出量为0.3 pg，经核酸杂交验证该法具有很高的特异性和敏感性。谢芝勋等[14]等根据NDV和IBV的基因文库，设计了两对分别与NDV和IBV某段基因互补的引物，用这两对引物对同一样品中NDV和IBV RNA模板进行多重RT-PCR扩增带通过敏感性检测，结果表明该多重RT-PCR最低同时检出10 bp的NDV和100 bp的IBV模板，且克服了一次PCR反应只能诊断一种疾病的缺点，可以从临床样品和环境样品中直接检测到NDV和IBV。王泽霖等[15-16]鉴定新分离毒株的毒力，结果与传统生物学试验完全吻合，但这种方法要求病毒

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