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第二章基因工程中常见的工具酶
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰
其它酶类--用于生物细胞的破壁、 转化、 核酸纯化、 检测等。 §2-1核酸内切限制酶
定义: 核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列, 并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 到当前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。
核酸内切限制酶的发现及其生物功能( 图) 一、 限制修饰系统的种类( 图) 二、 限制性内切酶的定义、 命名
1.定义: 广义指上述三个系统中的限制酶; 狭义指II型限制酶。 2.命名: 限制酶由三部分构成, 即菌种名、 菌系编号、 分离顺序。
例如: HindⅢ 前三个字母来自于菌种名称H.influenzae, ”ｄ”表示菌系为ｄ型血清型; ”Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 EcoRI—EscherichiacoliRI
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HindⅢ—HaemophilusinfluensaedⅢ SacI(II)—StreptomycesachromagenesI(Ⅱ) 三、 Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点
a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列, 但它们的切割作用却是随机的, 在距特异性位点至少1000bp的地方能够随机地切割DNA分子, 因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。——远距离随机切割
b.Ⅲ型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分子。——远距离定点切割
c.Ⅰ型核酸内切限制酶和Ⅲ型核酸内切限制酶, 在切割反应过程中, 都会沿着DNA分子移动, 因此是一种需要能量的过程。——需要能量的反应
d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶, 一般都是大型的多亚基的复合物, 既具有内切酶活性, 又具有甲基化酶活性。——内切酶活性和甲基化酶活性
四、 Ⅱ型核酸内切限制酶的特点
(1)基本特点:
①在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列, 即所谓的识别序列, 并由此切割DNA分子形成链的断裂; ——识别序列
②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布, 一般不是彼此直接相正确; ——单链切割部位
③因此, 断裂的结果形成的DNA片段, 也往往具有互补的单链
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延伸末端
④此类型核酸内切限制酶比较简单, 不需要能量分子ATP, 但需加入Mg++离子, 而且是从其识别序列内部切割DNA分子 ⑤在结构上是一种单一的成分, 即与Ⅰ型Ⅲ型酶不同, 不具有多种亚基成分;
(2)识别位点又称切割位点、 识别序列或靶子序列。绝大多数Ⅱ型核酸内切限制酶都能够识别由4、 5、 6或7个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。例如EcoRI识别的序列是GAATTC, 我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。呈典型的旋转对称型回文结构
(3)平末端与粘性末端
由核酸内切限制酶的作用而造成的DNA分子的断裂作用, 一般有下列两种不同的方式:
两条链上的断裂位置是处于一个对称结构的中心, 结果形成——具平末端的DNA片段。Bluntends
两条链上的断裂位置是交错地、 但又是对称地围绕着一个对轴排列, 结果形成——具粘性末端的DNA片段。Cohesiveends 粘性末端概念(定义): ( 图)
*是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链末端的结构, 它们能够经过互补碱基间的相互作用而重新环化起来。
(4)限制酶的识别序列与切割频率
基因工程中常用的工具酶模板
