南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2020，51（2）：267-2742期2095-1191；ISSNCODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com·267·DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2020.02.003外源氯化钙对高温胁迫下茅苍术生长生理指标
及叶片关键酶基因表达的影响
夏
蕴1，谷巍1*，巢建国1*，盛业龙2，王玉卓1，惠西珂1，王
（1南京中医药大学药学院，南京
凯1，王圆圆1
213000）
210023；2常州市孟河双峰中草药科技有限公司，江苏常州
摘要：【目的】探讨外源氯化钙对高温下茅苍术生长生理指标及叶片关键酶基因表达的影响，以期为缓解茅苍术高温伤害及其耐热生长提供参考依据。【方法】以二年生茅苍术种苗为试验材料，采用盆栽方式，以不添加氯化钙的超纯水（0mmol/L）为对照，采用无水氯化钙配制4个不同浓度的氯化钙溶液（5、10、15和20mmol/L）对茅苍术进行高温前喷施处理，高温胁迫5d后分别统计各处理叶片的黄叶数量，取样进行生理指标和叶绿素荧光参数测定，并测定各处理叶片的关键酶基因表达量。【结果】经5d高温胁迫后，与对照相比，5~10mmol/L氯化钙溶液处理能有效减少茅苍术叶片黄化现象，抑制叶绿素分解，叶片超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性及叶绿素含量显著增加（P<0.05，下同），丙二醛（MDA）含量和相对电导率显著降低，叶绿素荧光参数整体呈上升趋势，同时还能正向调节法呢基焦磷酸合成酶（FPPS）和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGR）基因表达量，综合作用效果尤以10mmol/L氯化钙溶液处理最佳，其POD活性（2070.526U/g）、叶绿素含量（1.906mg/g）、PSII最大量子效率（0.144）、非光化学猝灭系数（1.946）、表观电子传递速率（31.509）及FPPS基因表达量（1.809）均为最高。当氯化钙溶液浓度增大至15~20mmol/L时，茅苍术外观、生理指标及关键酶基因表达等均受到抑制，缓解高温胁迫效果不佳。【结论】低浓度（5~10mmol/L）的外源氯化钙可增强茅苍术的耐热性，有效缓解高温胁迫对其生长造成的伤害，有助于其生长。
关键词：茅苍术；外源氯化钙；生长生理指标；关键酶基因表达量中图分类号：S567.211
文献标志码：A
文章编号：2095-1191（2020）02-0267-08
EffectsofexogenouscalciumchlorideongrowthphysiologicalindexesandleafkeyenzymegeneexpressionofAtractylodes
lancea（Thunb.）DC.underhightemperaturestress
XIAYun1，GUWei1*，CHAOJian-guo1*，SHENGYe-long2，WANGYu-zhuo1，
HUIXi-ke1，WANGKai1，WANGYuan-yuan1
2
（1SchoolofPharmacy，NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanjing210023，China；Changzhou
MengheShuangfengChineseHerbalMedicineTechnologyCo.，Ltd.，Changzhou，Jiangsu213000，China）
Abstract：【Objective】ToinvestigatetheeffectsofexogenouscalciumchlorideonthephysiologicalindexesandtheexpressionofkeyenzymegenesinleavesofAtractylodeslancea（Thunb.）DC.underhightemperature，withaviewtopro-vidingareferencebasisforalleviatingtheinjuryofhightemperatureonA.lanceaanditsheat-resistantgrowth.【Method】TakingbiennialA.lanceaseedlingsastestmaterials，usingpottedmethod，usingultrapurewaterwithoutaddingcalciumchloride（0mmol/L）ascontrol，andanhydrouscalciumchloridewasusedtopreparefourdifferentconcentrationsofcalciumchloridesolutions（5，10，15and20mmol/L）forhightemperaturepre-spraytreatmentofA.lancea.After5dofhightemperaturestress，theyellowleavesofeachtreatedgroupwerecountedandsampledforphysiologicalindicatorsandchlorophyllfluorescenceparametersdetection，andeachexpressionofkeyenzymegenesintreatedleavesweremea-sured.【Result】After5dofhightemperaturestress，comparedwiththecontrol，5-10mmol/LcalciumchloridesolutiontreatmentcouldeffectivelyreducetheyellowingphenomenonofA.lancealeaves，inhibitchlorophylldecomposition，and收稿日期：2019-11-16基金项目：国家自然科学基金项目（81573520）；中医药公共卫生服务补助专项“全国中药资源普查项目”（财社〔2018〕43号）；江
苏省中药资源产业化过程协同中心项目（ZDXM-3-24）；江苏省基础研究计划（自然科学基金）面上项目（BK20171312）
作者简介：*为通讯作者：谷巍（1969-），教授，主要从事中药资源生产与合成生物学研究工作，E-mail：guwei9926@126.com；巢建
国（1960-），教授，主要从事中药资源开发利用研究工作，E-mail：jgchao1016@163.com。夏蕴（1994-），研究方向为中药学，E-mail：1115788919@qq.com
·268·南方农业学报51卷significantlyincreaseleafsuperoxidedismutase（SOD），peroxidase（POD）andcatalase（CAT）activitiesandchlorophyll
content（P<0.05，thesamebelow）.Thecontentofmalondialdehyde（MDA）andtherelativeconductivityweresignificantlyreduced，andtheoverallchlorophyllfluorescenceparametersshowedanupwardtrend.Atthesametime，theexpressionofkeyenzymegenesoffarnesyldiphosphatesynthase（FPPS）and3-hydrox-3-methylglutarylcoenzymeA（HMGR）werealsopositivelyregulated，andcomprehensiveeffectwasthebestwhentreatedwith10mmol/Lcalciumchloridesolution.ItsPODactivity（2070.526U/g），chlorophyllcontent（1.906mg/g），PSIImaximumquantumefficiency（0.144），non-photochemicalquenchingcoefficient（1.946），apparentelectrontransferrate（31.509）andFPPSgeneexpression（1.809）werethehighest.Whentheconcentrationofcalciumchloridesolutionwasincreasedto15-20mmol/L，theappearance，physiologicalindicatorsandkeyenzymegeneexpressionofA.lanceawereinhibited，andtheeffectsofalleviatinghightemperaturestresswasnotgood.【Conclusion】Low-concentration（5-10mmol/L）exogenouscalciumchloridecanen-hancetheheatresistanceofA.lancea，whicheffectivelyalleviatesthedamagecausedbyhightemperaturestressandhelpsitsgrowth.
Keywords：Atractylodeslancea（Thunb.）DC.；exogenouscalciumchloride；growthandphysiologicalindex；keyenzymegeneexpression
Foundationitem：NationalNaturalScienceFoundationofChina（81573520）；ChineseMedicinePublicHealthSer-viceSubsidy“NationalTraditionalChineseMedicineResourcesSurveyProject”（Caishe〔2018〕No.43）；JiangsuTradi-tionalChineseMedicineResourcesIndustrializationProcessCooperativeCenterProject（ZDXM-3-24）；GeneralProjectofJiangsuBasicResearchPlan（NaturalScienceFoundation）（BK20171312）
0引言
【研究意义】苍术［AtractylodesLancea（Thunb.）DC.］主治风寒、风湿痹痛等病症（张玉秀和李桂娟，2019），为临床处方常用药，茅山为其道地产区。近年来，茅苍术种植面积虽不断增加，但伴随着全球气候增温的趋势，高温胁迫已对茅苍术生长造成了较大影响。有研究表明，施加外源物质可在一定程度上缓解逆境胁迫对植物造成的伤害，如氯化钙可改善植物光合结构效应（张浩等，2019），促进酶活性（丁能飞等，2010），提高叶绿素和可溶性蛋白含量，降低丙二醛（MDA）含量（安钰等，2019），同时还可改善植物的不良生长状况（於晓伟，2018）。因此，研究氯化钙缓解茅苍术高温伤害的作用机理和响应变化，可为茅苍术的抗逆生长提供参考依据。【前人研究进展】钙离子为植物生长发育的必需元素之一，作为信号转导的第二信使，具有维持细胞稳定性，调节生理功能等作用（朱晓军等，2004；Houetal.，2019）。陈莹等（2014）研究表明，外源钙可增强干旱胁迫下木豆种苗的可溶性蛋白质和谷胱甘肽（GSH）含量，但对其种子萌发的促进作用不显著。林啸等（2014）研究发现，外源钙可有效缓解镉胁迫对白菜的伤害，同时还能提高白菜的内源NO表达和钙含量。赵娟等（2016）研究指出，5~15mmol/L的钙溶液可增强玉米的耐冷性生长能力。刘国花等（2017）研究发现，氯化钙处理可降低低温下尾巨桉幼苗的MDA及脱落酸（ABA）含量，提高内源激素含量和酶活水平，以10mmol/L浓度的效果最佳。郝正刚等（2019）研究发现，施加钙可有效缓解镉胁迫对甜高粱的光合抑制作用，以3.0mmol/L浓度处理效果最佳。黄璐瑶等（2019）研究发现，施加外源钙后，可有效提高盐胁
迫下金银花Rubisco酶大亚基编码基因rbcL和叶绿
素a/b结合蛋白编码基因Cab的表达，其中rbcL基因表达变化更敏感。任珺等（2019）研究了外源钙对盐胁迫下苦豆子生长的影响，认为氯化钙有助于苦豆子的萌发和生长，有减轻盐胁迫的作用。伍宝朵等（2019）研究认为，适宜浓度的外源钙可减轻低温对胡椒的寒害程度，提高胡椒的酶活性，减少细胞膜损伤，但浓度过高会产生抑制效果。徐宗艺等（2019）研究发现，施加氯化钙可有效减轻酸雨胁迫下烟草的失绿现象，提高其光能传递速率，减轻光能损耗。【本研究切入点】本课题组前期已研究了多种逆境胁迫对茅苍术生长的影响，为完善茅苍术的抗逆栽培，需进一步研究外源物质对缓解茅苍术逆境伤害的影响。【拟解决的关键问题】以二年生茅苍术种苗为试验材料，在高温来临前提前喷施不同浓度的氯化钙溶液，研究不同浓度氯化钙对高温胁迫下茅苍术生长生理指标和叶片关键酶基因表达的影响及其作用机理，为缓解茅苍术高温伤害及其耐热生长提供参考依据。
1材料与方法
1.1
试验材料
试验选用二年生茅苍术种苗，2018年12月28日种植在江苏省常州市新北区双峰中草药基地（东经119°47′56.60″，北纬32°01′28.97″），经南京中医药大学中药资源与开发教研室巢建国教授鉴定为菊科植物苍术［Atractylodeslancea（Thunb.）DC.］的根茎。无水氯化钙为分析纯，配制用水为超纯水。1.2试验方法
试验于2019年7月在常州市新北区双峰中草药基地内进行，采用盆栽方式，土样取自基地。土壤含
2期夏蕴等：外源氯化钙对高温胁迫下茅苍术生长生理指标及叶片关键酶基因表达的影响
·269·铵态氮11.773mg/kg、速效磷11.107mg/kg、速效钾11.360mg/kg。
采用无水氯化钙配制4个不同浓度氯化钙溶液（用超纯水配制），分别为Ca5组（5mmol/L）、Ca10组（10mmol/L）、Ca15组（15mmol/L）和Ca20组（20mmol/L），以Ca0组（0mmol/L）为对照。选取植株大小相近的二年生茅苍术种苗移栽至花盆内，每盆3株，每组6盆，待其生长稳定后，于7月5日起每天18：00分别喷施不同浓度的氯化钙溶液于各组茅苍术叶面，以叶片滴液为宜，连续喷施处理7d，之后搬至温室大棚内进行40℃高温处理5d，然后观察统计各处理茅苍术叶片的颜色及黄叶数量，并取各组距顶端7~8cm处绿色未发黄新鲜叶片，混匀，剪碎，进行生理指标测定（每组3个重复），选取功能叶片（各组倒数第2片叶片）进行叶绿素荧光参数测定（每组5个重复），同时取新鲜叶片约0.1g预存在-80℃冰箱中，待测其叶片3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutarylcoen-zymeA，HMGR）和法呢基焦磷酸合酶（Farnesylpy-rophosphatesynthase，FPPS）基因表达量。1.3测定指标及方法
观察并统计经喷施不同浓度氯化钙溶液后，受高温处理的茅苍术幼苗的外观形态特征，统计各组黄叶数。
表1qRT-PCR引物序列
Table1PrimersequencesofqRT-PCR
基因GeneUBQ（内参）（reference）HMGRFPPS
选取各组大小、长势相近的植株叶片，去除叶
脉，剪碎，混匀，设3个重复，进行生理指标测定：采用紫外吸收法测定过氧化氢酶（CAT）活性，愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性，超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（南京建成生物工程公司）检测总SOD活性，DDS-11A型电导率仪测定电导率，乙醇法测定叶绿素含量，硫代巴比妥酸法测定MDA含量。
茅苍术高温处理5d后，利用LI-6400型便携式光合测定仪选取各组功能叶片5片，预先对叶片进行暗适应30min后测定Fm、Fo等暗适应荧光参数，根据以上参数计算得到PSII最大量子效率（Fv/Fm）、光化学猝灭系数（qP）、非光化学猝灭系数（NPQ）和电子传递效率（ETR）等参数。
参照RNA提取试剂盒（TIANGEN公司）说明书提取高温胁迫5d后茅苍术叶片的RNA，反转录为cDNA，进行PCR荧光定量测定。反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，45个循环。利用2-ΔΔCt法（以0mmol/L氯化钙溶液组为参照）进行计算，对不同浓度氯化钙溶液处理的茅苍术叶片关键酶基因表达量差异进行分析。qRT-PCR引物序列（课题组成员前期筛选得出）见表1。1.4统计分析
叶片关键酶基因应用GraphPadPrism5.0进行图表绘制，其余指标利用SPSS22.0进行单因素方差分析。
序列Sequence
F：5'-ACCAACTGGGTTGACAACTGAAGT-3'R：5'-AGCCTCGGTAAGGGCTTCAT-3'F：5'-AAACAACATAAATCCGGCGAACT-3'
R：5'-AGGCGTCGATGGCTTTTG-3'F：5'-CTGCCCTTGGTTGGTGCGTT-3'R：5'-TTCTTGGGACATGGTTGCGA-3'
Ca0
Ca5
扩增长度（bp）Amplifiedlength
64
61206
2结果与分析
2.1外源氯化钙对茅苍术叶片颜色和黄叶数的影响2.1.1叶片颜色由图1可知，Ca0组未经氯化钙处理的茅苍术叶片发黄、失绿严重，说明高温胁迫会导致其叶绿素分解，使叶片发黄。经低浓度（5和10mmol/L）氯化钙溶液处理后，Ca5和Ca10组茅苍术叶片发黄程度有所缓解，以Ca10组效果较佳；随着氯化钙溶液浓度的增加，茅苍术叶片发黄程度不再受到抑制，且浓度越高叶片发黄程度越接近于Ca0组。说明喷施适宜浓度的氯化钙溶液能有效缓解茅苍术叶片发黄，氯化钙溶液浓度过高时反而会导致叶片发黄严重。
Ca10Ca15Ca20
图1不同处理组茅苍术高温胁迫5d后叶片颜色对比Fig.1ComparisonofleafcolorofA.lancea（Thunb.）DC.in
differenttreatmentgroupsafter5dhightemperaturestress
2.1.2叶片枯黄数量由表2可知，Ca0组茅苍术叶片黄叶数最多，经低浓度（5和10mmol/L）氯化钙溶液处理后，Ca5和Ca10组茅苍术叶片黄叶数较Ca0组明显减少，而经高浓度（15和20mmol/L）氯化钙溶
外源氯化钙对高温胁迫下茅苍术生长生理指标<p>及叶片关键酶基因表达的影响</p><p><br/></p>
