医院细胞遗传室人羊水细胞培养及染色体制备作业指导书 1 目的
规范羊水标本细胞培养及染色体制备过程，为临床羊水细胞染色体核型分析可靠性提供质量保证。 2 测定方法
CO2培养/手工收获。 3 测定原理
人的羊水细胞能长成单层并可连续进行传代培养，但它们的一些特征与一般成纤维细胞不同。在羊水中存在着各种不同类型的胎儿细胞，依据其外形和生长特征可分为以下三类：上皮细胞（E）、成纤维细胞（F）和羊水细胞（AF）。E细胞在胰酶消化的连续培养中不再生长，所以在培养过程中的生长期最短。AF细胞在培养初期就长得很好，染色体分析大多用这类细胞。F细胞在培养中的生长期最长，在较老的羊水培养物中占优势。通常在培养后3-4天（可能更早些）即出现E细胞的集落，它们不适合作染色体分析。大约在第7天出现的AF细胞可用于染色体制备。如果在培养后第10天还未见长出新的细胞，就应考虑第二次羊膜穿刺。 4 性能特征
经G显带处理后可见300-550条显带。 5 样本类型及受检者准备
在无菌条件下抽得妊娠16-22+6周羊水后，注入15ml一次性离心管中，约抽30ml，立即送检。 6 试剂
6.1 完全培养基100ml：在超净工作台内，用移液管将培养
基和其他各试剂分装入100毫升无菌瓶中（商业化培养基或F10培养基70ml，胎牛血清30ml，双抗：青霉素和链霉素，终浓度为100U/ml，用3.5%碳酸氢钠调节pH为7.2-7.4）。
6.2 秋水仙素浓度：20μg/ml。 6.3 低渗液：0.075mol/L的KCl溶液 6.4 卡诺固定液 6.5 0.25% EDTA-trypsin 6.6 生理盐水 7 仪器及耗材
酒精灯，烧杯，天平，离心机，CO2培养箱，冰盒，载玻片，玻片盒，光学显微镜，灭菌注射器（5ml），离心管，无菌吸管，量筒，培养瓶，试剂瓶等。 8 操作程序 8.1 细胞接种与培养
8.1.1 在无菌条件下抽得妊娠16-22+6周羊水后，注入15ml
一次性离心管中，约抽30ml，
立即送检。
8.1.2 以1500rpm离心10min。
8.1.3 进接种培养室，在超净工作台上吸去上清液，每管约
留0.5ml，吸管打散细胞。制成细胞悬液，再加入约4.5ml完全培养基入管内，吸管充分混匀，移至25cm
2
方形培养瓶中，置含5%CO2的37℃温箱行开放式培养。 8.1.4 一般5天后镜下观察，可见成纤维样或上皮细胞生长，
当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细胞时，视情况（有较好的梭形细胞克隆）可换上完全培养基，继续培养24-48小时，如细胞生长状况好，即可加入秋水仙素0.04 -0.08μg/ml, (1ml注射器垂直加20μg/ml秋水仙素2滴)4-6小时左右后行细胞学处理。 8.2 细胞收获
8.2.1 倒出瓶中细胞上清液入10ml离心管中，生理盐水冲洗
培养瓶细胞面两遍。
8.2.2 使用0.25% EDTA-trypsin消化3-5分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改变时即用吸管吹打细胞，加入上清液或完全培养基终止消化。
8.2.3 收集细胞悬液：离心，1500rpm，10min，去上清。 8.2.4低渗：加入0.075M KCl 4-6ml，吸管吹打，37℃水浴3-5min。
8.2.5 预固定：加入1.5ml固定剂，轻混匀37℃水浴5min，
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