植物体内氧自由基含量 - 过氧化氢 - 丙二醛 - 脯氨酸的测定

植物体内氧自由基含量的测定

一、目的

生物体内的一部分氧分子，在参与酶促或非酶促反应时，若只接受一个电子，会转变为

－－

超氧阴离子自由基（O2）。O2 既能与体内的蛋白质和核酸等活性物质直接作用，又能衍生

1

为H2O2羟自由基（·OH）、单线态氧（O2）等。·OH可以引发不饱和脂肪酸脂质（RH）过氧化反应，产生一系列自由基，如：脂质自由基（·R）、脂氧自由基（RO·）、脂过氧自由基（ROO·）和脂过氧化物（ROOH），自由基积累过多时会对细胞膜及许多生物大分子产生破坏作用。本实验主要掌握植物体内氧自由基的测定原理及方法。 二、原理

－

在生物体中，氧作为电子传递的受体，得到单电子时，生成超氧阴离子自由基（O2）。

－－－－

利用羟胺氧化的方法可以测定生物系统中O2含量。O2与羟胺反应生成NO2，NO2在对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成粉红色的偶氮染料（对－苯磺酸－偶氮－α－萘胺）。取

－

生成物在530nm波长处测定吸光度（A）值，根据A530值可以算出样品中O2含量。反应式如下：

－ ＋ －

NH2OH + 2O2＋ H→ NO2 ＋ H2O2 ＋ H2O 三、材料、仪器设备及试剂

1. 材料：花生、绿豆、大豆黄化幼苗的下胚轴及其他植物叶片。

2. 仪器设备：高速冷冻离心机；分光光度计；恒温水浴锅；研钵；试管；移液管；试管架；移液管架；洗耳球等。 3. 试剂配制：

－1－1

50 mmol·L磷酸缓冲液（pH7.8）最好利用磷酸钾65 mmol·L

－1

10/1 mmol·L盐酸羟胺

－1

58/17 mmol·L对氨基苯磺酸（以冰醋酸 ：水 = 3 ：1配制）

－1

7 mmol·L α－萘胺（以冰醋酸 ：水 = 3 ：1配制）

－1

50nmol·mlNaNO2母液 四、实验步骤 1. 提取液制备

－1

称取1g植物叶片放入冰浴的研钵中，加入50mmol·L磷酸缓冲液（pH7.8）5ml, 研磨成匀浆，在1000r/min，4℃下离心10min，取上清液再以15000r/min，4℃下离心20min，第二次上清液即为样品提取液。 2. 亚硝酸根标准曲线的制作 2.1系列浓度NaNO2溶液的配制

－1－1

取50nmol·mlNaNO2母液，分别稀释成0、10、20、30、40和50、nmol·ml的标准稀释液。

－1

2.2取7支试管，编0～6号，分别加10、15、20、30、40、50、nmol·mlNaNO2标准稀

－1－1

释液1ml，0号管加蒸馏水1ml，然后各管再加50mmol·L磷酸缓冲液1ml，17 mmol·L

－1

对氨基苯磺酸1ml和7 mmol·L α－萘胺1ml，置于25℃显色20min后，以0号管作空白对照，在530nm波长处测定吸光度（A）值。 2.3 标准曲线绘制

－

以1～6号管亚硝酸根（NO2）浓度为横坐标，吸光度值作纵坐标，绘制标准曲线。 －

3. O2含量测定

取4支试管，编0～3号，1～号管分别加入样品提取液0.5ml（三个重复），0号管加

－1－1

蒸馏水0.5ml，然后各管加入50mmol·L磷酸缓冲液0.5ml，1 mmol·L盐酸羟胺1ml，

－1－1

混匀，置于25℃ 1 h后，各管再加入17 mmol·L对氨基苯磺酸1ml和7 mmol·Lα－

萘胺1ml，混匀，置于25℃显色20min，以0号管为空白对照，在530nm波长处测定吸光度（A）值。 五、结果计算

－

根据所测得的A530值，从标准曲线上查得样品中NO2浓度，按公式（1）即可计算出样－－－－

品中NO2浓度。然后依据羟胺与O2的上述反应，从NO2对O2进行化学计量，按公式（2）

－－

计算，即将按公式（1）计算得到的NO2浓度乘2，得O2浓度。也可根据被测样品与羟胺反

－

应的时间和样品中蛋白质含量，按公式（3）求得O2的生产率。

－

从标准曲线查得NO2（nmol）×提取液总量（ml）

－－1

NO2含量（nmol·gFw）=——————————————————————…（1） 样品重（g）×测定时提取液用量（ml）

－－

将所得NO2含量代入下式计算，即求出O2含量。 －－－1

O2含量= NO2（nmol·gFw）×2 ……………………………………………… （2）

－－

将公式（2）所得的O2浓度及样品中蛋白质含量，依下式计算出O2产生速率。

－

O2（nmol）

－－1－1

O2产生速率（nmol·mg蛋白·min）= ———————————————…（3） 蛋白质（mg）× 反应时间（min）

六、注意事项

如果样品中含有大量叶绿素将干扰测定，可在样品液与羟胺温浴后，加入等体积乙醚提取叶绿素。

植物组织中过氧化氢含量

植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。

一、过氧化氢含量的测定

【原理】

H2O2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被H２SO4溶解后，在415nm波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与H2O2浓度呈线性关系。

【仪器和用具】

研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。

【试剂】

100μmol/L H2O2丙酮试剂：取30%分析纯H2O2 57μl，溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L

硫酸；5%（W/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。 【方法】

1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表40-1加入试剂。

表40-1 测定H2O2浓度标准曲线配置表 试剂（ml） 100μmol/L H2O2 4℃下预冷丙酮 5%硫酸钛 浓氨水 2mol 硫酸 5.0 离 心 管 号 1 0 1.0 0.1 0.2 2 0.1 0.9 0.1 0.2 5.0 3 0.2 0.8 0.1 0.2 5.0 4 0.4 0.6 0.1 0.2 5.0 5 0.6 0.4 0.1 0.2 5.0 6 0.8 0.2 0.1 0.2 5.0 7 1.0 0 0.1 0.2 5.0 3000r/min 离心10min，弃去上清夜，留沉淀 待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。

2.样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织2~5g（视H2O2含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000 r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。 3.结果计算：

C?Vt 植物组织中H2O2含量(μmol/g Fw)=FW?V1

式中 C—标准曲线上查得样品中H2O2浓度（μmol）； Vt—样品提取液总体积（ml）； V1—测定时用样品提取液体积（ml）；

FW—植物组织鲜重（g）。

植物体内游离脯氨酸含量的测定

一、目的

在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。 二、原理

磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化

合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。 三、材料、仪器及试剂 1. 材料：植物叶片。

2. 仪器：分光光度计；电子分析天平；离心机；小烧杯；普通试管；移液管；注射器；恒温水浴锅；漏斗；漏斗架；滤纸；剪刀；洗耳球。 3 .试剂及配制：

－1

2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。

3％磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。

-1

10μg·ml脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏

－1

水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100μg·ml脯氨酸母液），再

-1

吸取该溶液10ml, 加蒸馏水稀释定容至100ml, 即为10μg·ml脯氨酸标准液。

冰醋酸；甲苯。 四、实验步骤

1. 脯氨酸标准曲线的制作

1.1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～12μg的脯氨酸标准液。

加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。取出冷却，各试管再加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。

试 剂 10μg·ml脯氨酸标准液（ml） 蒸馏水（ml） 冰醋酸（ml） 2.5﹪酸性茚三酮（ml） 每管脯氨酸含量（μg） -1管 号 0 0 2 2 2 0 1 0.2 1.8 2 2 2 2 0.4 1.6 2 2 4 3 0.6 1.4 2 2 6 4 0.8 1.2 2 2 8 5 1.0 1.0 2 2 10 1.2用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。 1.3标准曲线的绘制

以1～5号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 2. 样品的测定 2.1脯氨酸的提取

称取不同处理的植物叶片各0.5g，分别置大试管中，然后向各管分别加入5ml 3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。 2.2测定

吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml 2.5﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000r/min离心5min。

用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。

五、计算结果

从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：

X × 提取液总量（ml）

－1

脯氨酸含量（μg·gFw）＝ ——————————————————— 样品鲜重（g）× 测定时提取液用量（ml）

公式中：X －从标准曲线中查得的脯氨酸含量（μg）

植物体内丙二醛含量的测定

一、目的

通过实验，掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。 二、原理

丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5－三甲基恶唑2、4－二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组

－13＋

织中铁离子的含量为100－300μg·gDw，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe的终

－1

浓度为0.5nmol· L。在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。

三、材料、仪器设备及试剂 1. 材料：植物叶片。 2. 仪器设备：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管（1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。

3. 试剂：10％三氯乙酸；0.6％硫代巴比妥酸（TBA）溶液：石英砂。 四、实验步骤

1. 丙二醛的提取

称取受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片1g，加入少量石英砂和10％三氯乙酸2ml，研磨至匀浆，再加8ml10％三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液。 2. 显色反应及测定

取4支干净试管，编号，3支为样品管（三个重复），各加入提取液2ml，对照管加蒸馏水2ml，然后各管再加入2ml 0.6％硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混合液在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液分别在532、600和450nm波长下测定吸光度（A）值。

五、丙二醛含量计算：

－3

由于蔗糖－TBA反应产物的最大吸收波长为450nm，毫摩尔吸收系数为85.4×10，MDA

－3－3

－TBA反应产物在532nm的毫摩尔吸收系数分别是7.4×10和155×10。532nm非特异性吸光值可以600nm波长处的吸光值代表。

按双组分分光光度法原理，建立方程组，解此方程组即可求出MDA及可溶性糖浓度。 方程组：

－3

A450=（85.4×10）·C糖

－3－3

（A532－A600）=（155×10）·CMDA+（7.4×10）·C糖 解得：

A450

－1

C糖= —————— = 11.71A450（mmol·L）

－3

85.4×10

－1

CMDA= 6.45（A532－A600）－0.56A450-（μmol·L）

公式中：A450—在450nm波长下测得的吸光度值

A532—在532nm波长下测得的吸光度值 A600—在600nm波长下测得的吸光度值

5

﹡ —1.55×10为摩尔比吸收系数

C糖、CMDA分别是反应混合液中可溶性糖、MDA的浓度。

1. 按下式计算提取液中MDA浓度

反应液体积（ml）

CMDA × ————————— 1000

－1

提取液中MDA浓度（μmol·ml）= ——————————————— 测定时提取液用量（ml）

2. 按下式计算样品中MDA含量

－1

提取液中MDA浓度（μmol·ml）×提取液总量（ml）

－1

MDA含量（μmol·g Fw）= ———————————————————————— 植物组织鲜重（g）