个传递是通过亚基构象的改变而实现的。（血红蛋白）
? 蛋白质空间构象改变可引起疾病：一些蛋白质尽管其一级结构不变，但折叠发生错误，
使其构象发生改变，进而影响到其正常功能，严重时可导致疾病的发生。因蛋白质折叠错误或折叠导致构象异常变化而引起的疾病，成为蛋白质构象病。（朊病毒） 第五节 蛋白质的性质
? 蛋白质的两性解离与等电点：体多数蛋白质的酸碱氨基酸比例相近，其等电点大多为中
性偏酸，约在5.0左右。所以在生理条件下（pH约为7.4），它们大都以负离子形式存在。
? 蛋白质的变性：天然蛋白质分子受环境因素的影响，从有规则的紧密结构变为无规则的
松散状态，即变性作用。构象的破坏是蛋白质变性的结构基础。在某些物理/化学因素的作用下，蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏，进而导致其理化性质发生改变和生物活性降低或丧失，这种现象称为蛋白质的变性作用。蛋白质变性作用的本质是破坏了形成与稳定蛋白质分子空间构象的各种次级键从而导致其空间构象的改变或破坏，并不涉及一级结构的改变和肽键的断裂。变性作用有以下特征：生物活性丧失和理化性质改变（溶解度降低、黏度增加、结晶能力消失、易被蛋白酶水解）。分可逆变性和不可逆变性。
? 蛋白质的胶体性质：蛋白质分子直径在2~20nm，在溶液中易形成大小介于1~100nm的
质点。蛋白质表面易于发生水合作用形成水化层，使蛋白质颗粒不致聚集而沉淀。蛋白质表面具有同性电荷，与周围的反离子构成双电层。
? 蛋白质的沉淀反应：①中性盐沉淀反应。逐渐向蛋白质溶液中加入中性盐，低盐浓度可
使蛋白质溶解度增加，这种现象称为盐溶，其原因为蛋白质表面吸附了某种离子，导致其颗粒表面同性电荷增加而排斥加强，同时与水分子作用也增强，从而提高了其溶解度；随着盐浓度的不断增加，因蛋白质水化层的破坏并中和了其表面电荷，而促使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀，这种现象被称为盐析。主要特点是沉淀出的蛋白质不变性。②加热使蛋白质凝固变性。③加入有机溶剂使蛋白质表面水化层削弱或破坏并使其介电常数降低而增加带电质点的相互作用，从而使得蛋白质颗粒更易相互聚集沉淀。有时可引起蛋白质变性。④重金属盐沉淀反应。蛋白质在pH大于pI的溶液中呈负离子，可与重金属
离子结合成不溶性蛋白盐或蛋白络合物而沉淀。⑤生物碱试剂的沉淀反应。蛋白质在pH小于pI时呈正离子，可与生物碱试剂结合成不溶性盐而沉淀。
? 蛋白质分子量的测定：蛋白质分子量一般为1x104 ~ 1x106Da或更高。蛋白质在溶液中的
形状可根据不对称常数分为球形、椭圆形、纤维状等。①凝胶过滤法。②SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。③生物质谱法。（详见书P48-49）
? 蛋白质分子的免疫学性质。凡能刺激机体免疫系统产生免疫应答，并能与相应的抗体和
（或）致敏淋巴细胞受体发生特异性结合的物质，统称为抗原。异物性、大分子性、特异性。抗原刺激机体产生能与相应抗原特异结合并具有免疫功能的免疫球蛋白，称为抗体。注意抗体与免疫球蛋白之间的区分。
? 蛋白质免疫性质的应用：①疾病的免疫预防：卡介苗、脊髓灰质炎糖丸疫苗、白喉类毒
素、乙肝的基因工程疫苗等； ②疾病的免疫诊断：α-甲胎蛋白诊断肝癌，血型、 HBsAg检测等；③疾病的免疫治疗：破伤风抗毒素、狂犬病毒抗血清、抗蛇毒抗毒素、胸腺素和干扰素等，单克隆抗体也常作为靶向药物载体用于肿瘤治疗；④免疫分析：免疫扩散、免疫电泳；⑤标记免疫分析：放射免疫分析（RIA）、酶联免疫分析（EIA）、荧光标记免疫分析等；⑥免疫分离纯化：免疫亲和层析。
? 蛋白质的紫外吸收：由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm
波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。蛋白质浓度mg/ml＝1.45A280 - 0.74A260
? 蛋白质的呈色反应：①茚三酮反应。蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应，
生成蓝紫色化合物。②双缩脲反应。蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。
第六节 蛋白质的分离纯化与分析基本原理
? 蛋白质的提取：增加蛋白的纯度，以增加单位蛋白质中所需要的蛋白质重量和生物活性。
既要尽量提取所需目标的蛋白质，又要防止蛋白酶等的降解和其他因素对其空间构象的破坏作用。
? 根据蛋白质的溶解度差异分离：①等电点沉淀。蛋白质在等电点时溶解度最小。单纯使
用此法不易使蛋白质沉淀完全，常与其他方法配合使用。②盐析法。是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素被去除沉淀。优点：沉淀的蛋白质保持着它的天然构象，能 再溶解。③有机溶剂分级分离法。是将有机溶剂（丙酮、乙醇）加入蛋白质溶液中，导致溶液介电常数降低，增加了相反电荷之间的吸引力，蛋白质分子表面可解离基的离子化强度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。注意事项：使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃下进行。 蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离，防止变性。④温度对蛋白质溶解度的影响。一般在0～40℃，多数球状蛋白的溶解度随温度的升高而增加；40～50℃以上，多数蛋白质不稳定并开始变性。因此，对蛋白质的沉淀一般要求 低温条件。
? 根据蛋白质的分子量差异分离：①透析及超滤法。透析指利用透析袋把大分子蛋白质与
小分子化合物分开的方法 。只用于除盐类和小分子杂质。超过滤指应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。用于除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质。②凝胶过滤法。也称分子排阻层析，层析柱填满带有小孔的颗粒，一般由葡聚糖制成。蛋白质溶液加于柱顶部，小分子蛋白质进入孔，因而在柱中滞留时间较长，大分子不能进入孔而径直流出，因此不同大小的蛋白质得以分离。分子筛：具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成。常用分子筛有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。③密度梯度离心。蛋白质颗粒的沉降速度取决于它的大小和密度。当其在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时，即停滞不前，可分步收集进行分析。
? 根据蛋白质的电离性质差异分离：①电泳法。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝
胶电泳等。几种重要的蛋白质电泳：A.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。在蛋白质样品和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入带负电荷较多的十二烷基磺酸钠（SDS），使所有蛋白质颗粒表面覆盖有一层SDS分子，导致蛋白质分子间的电荷差异消失，此时蛋白质在电场中的泳动速率仅与蛋白质颗粒大小有关。常用于蛋白质分子量的测定。SDS的作用：a.由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的 电荷差异。b.SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用，巯基乙醇打开
二硫键，因此使蛋白质分子处于伸展状态。改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小成正比变化。B.醋酸纤维薄膜电泳。它以醋酸纤维薄膜作为支持物，电泳效果比纸电泳好，时间短、电泳图谱清晰。临床用于血浆蛋白电泳分析。C.等电聚焦电泳。在聚丙烯酰胺凝胶中加入系列两性电解质载体，在电场中形成一个连续而稳定的线性pH梯度，也即pH从凝胶的正极向负极依次递增，电泳时被分离蛋白质处在偏离其等电点的pH位置时带有电荷而移动，至该蛋白质pI值相等的pH区域时，其静电荷为零而不再移动，这种通过蛋白质的等电 点的差异而分离蛋白质的电泳方法称为等电聚焦电泳。D.双向凝胶电泳。第一向为蛋白质等电聚焦电泳，第二项为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过被分离蛋白质等电点和分子量的差异，将复杂蛋白质混合物在二维平面上分离。E.免疫电泳。把电泳技术和抗原与抗体反应的特异性相结合，一般以琼脂或琼脂糖凝胶为支持物。本法常用于蛋白质的鉴定及其纯度的检查。目前此类方法已有许多新的发展，如荧光免疫电泳、酶免疫电泳、放射免疫电泳、Western Blot分析等。②离子交换层析法。利用离子交换树脂作为支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。分类：阳离子交换树脂，带负电，如羧甲基纤维素等；阴离子交换树脂，带正电，如二乙基氨基乙基纤维素。③亲和层析分离。利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，把待纯化的某一蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到像琼脂糖凝胶一类表面的功能基，当蛋白质混合物加到填有亲和介质的层析柱时，待纯化的某一蛋白质则被吸附在含配体的琼脂糖颗粒表面上时，而其它的蛋白质则因对该配体无特异的结合部位而不被吸附，它们通过洗涤可除去，被特异结合蛋白质可用含游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来。
? 蛋白质纯度的鉴定：①层析法：用分子筛或离子交换层析检查样品时，如果样品是纯的
应显示单一的洗脱峰，称为“层析纯”。②电泳法：用PAGE检查样品呈现单一区带，也是纯度的一个指标，这表明样品在电荷和质量方面的均一性。纯的蛋白质电泳仅有一条区带，但仅有一条区带却不一定是纯的，仅能表明它在电泳上的均一性，称为“电泳纯”。③免疫化学法：免疫学技术是鉴定蛋白质纯度的有效方法，它根据抗原与抗体反应的特异性，可用已知抗体检查抗原或已知抗原检查抗体。④其他方法：还有超速离心法，蛋白质化学组成和结构分析等。
生物化学蛋白质化学
