２０１０年３月 湖南师范大学自然科学学报 Ｖ０１．３３ Ｎｏ．１ 第３３卷第１期 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｈｕｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍａｒ．，２０１０ 尿素、氯化铵、碳酸铵对牛奶样品微量 凯氏定氮法的干扰 袁炳秋 ，吕 媛 ，马 钰 ，戴玉明 ，刘彩云 ，曾 林 ，易银沙卜 （１．湖南师范大学医学院，中国长沙４１００８１；２．长沙赢润生物技术有限公司，中国长沙４１００１３） 摘要 用微量凯氏定氮法测定未加含氮干扰物质的牛奶蛋白含量，再用微量凯氏定氮法测定加尿素、氯化 铵、碳酸铵的牛奶蛋白含量，然后对添加含氮干扰物质前后牛奶蛋白含量进行比较．测定未加含氮干扰物质的牛奶 蛋白含量时，微量凯氏定氮法有较好的重复性和精确性，测定加尿素、氯化铵、碳酸铵的牛奶蛋白含量时，微量凯氏 定氮法的重复性和精确性很差．在加入干扰物质前后微量凯氏定氮法测定牛奶蛋白含量的相对误差几乎都大于 ５％．尿素、氯化铵、碳酸铵非蛋白含氮物质对微量凯氏定氮法测定牛奶蛋白含量具有明显的干扰作用，尿素、氯化 铵、碳酸铵非蛋白氮含量越多，对微量凯氏定氮法测定牛蛋白含量干扰越明显． 关键词蛋白含量；微量凯氏定氮法；牛奶；尿素；氯化铵；碳酸铵；干扰 中图分类号Ｒ１５５．５＋７ 文献标识码Ａ 文章编号１０００－２５３７（２０１０）０１－００６６－０５ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｕｒｅａ，ＡｍｍＯｎｉＵｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ ａｎｄ ＡｍｍＯｎｉｕｍ Ｃａｒｂｏｎａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｌｋ Ｓａｍｐｌｅ ｂｙ Ｍｉｃｒｏ—Ｋｊｅｌｄａｈｌ Ｍｅｔｈｏｄ ＹＵＡＮＢｉｎｇ—ｑｉｕ ，ＬＶ Ｙｕａｎ ，ＭＡ Ｙｕ ，ＤＡＩ Ｙｕ—ｒｕｉｎｇ ，ＬＩＵ Ｃａｉ－ｙｕｎ ，ＺｅｎｇＬｉｎ ，ＹＩ Ｙｉｎ—ｓｈａ ’ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｕｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０００６，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｃｈａｎｇｓｈａ Ｙｉｎｇｒｕｎ Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１００１３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｗｉｔｈ ａｎ ａｉｍ ｏｆ ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｕｒｅａ．ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ａｎｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｉｃｒｏ—Ｋｊｅｌｄａｈｌ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｍｉｌｋ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｔｈｅ Ｋｊｅｌｄａｈｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｒｅ ｅｘ— ｐｌｏｉｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔ｝Ｉｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｍｉｌｋ ｓａｍｐｌｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｎｏ ｕｒｅａ．ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ａｎｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｃａｌ＇－ ｂｏｎａｔｅ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｌｋ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ａｄｄｅｄ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｕｒｅａ，ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ａｎｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ ａｒｅ ｃｈｅｃｋ ｂｙ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｍｅｔｈｏｄ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｌ１ｅ ｍｉｌｋ ｓａｍｐｌｅ ｗｉｔｈ ｎｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｓｕｂ． ｓｔａｎｃｅ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｈｔｅ ｍｉｌｋ ｓａｍｐｌｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｄｄｉｔｉｖｅ ｈａｖｅ ａ ｈｉｇｈｅｒ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｃｙ．Ｂｏｔｈ ｏｆ ｈｔｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｌＴｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｓａｍｐｌｅｓ ｅｘｃｅｅｄ ５％ａｌｍｏｓｔ．Ｔｈｅ ｎｏｎ—ｐｒｏｔｅｉｎ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｓｕｃｈ ａｓ Ｕ— ｒｅａ，ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ ｗｉｈｔ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ．Ｋｊｅｌｄａｈ１． ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｏｆ ｈｔｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｓ ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｎ—ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｍｉｌｋ ｓａｍｐｌｅ；ｍｉｃｒｏ－Ｋｊｅｌｄａｈｌ ｍｅｔｈｏｄ；ｍｉｌｋ；ｕｒｅａ；ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ；ａｍｍｏ． ｎｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ；ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ 凯氏定氮法的普遍适用性、精确性和可重复性已经得到了国际的广泛认可 ¨．它已经被确定为检测食 品中蛋白质含量的标准方法 ．目前，牛奶中蛋白含量的测定主要采用国标法凯氏定氮法 引，该方法基于测 定含氮量来间接测定蛋白质含量，它与所测样品的蛋白质组成无关，不受样品颜色的影响，是美国食品药品 收稿日期：２００９－１２－１８ 基金项目：湖南省教育厅资助项目（０８Ａ０３６），湖南省科技厅资助项目（２００９ＣＫ３０７７） ·通讯作者．Ｅ－ｍａｉｌ：Ｌｙ５９８５９８＠１２６．ｅｏｍ 第１期 袁炳秋等：尿素、氯化铵、碳酸铵对牛奶样品微量凯氏定氮法的干扰 ６７ 监督局（ＦＤＡ）推荐的测定蛋白的方法Ｌ４ Ｊ．但是，这种方法并不能给出真实的蛋白质含量，因为凯氏定氮法所 测定的氮可能不仅仅是由蛋白质转化来的，它也可以是其他非蛋白质物质所转化的［５】，因此有些人便利用 凯氏定氮法这一缺陷往牛奶中加入各种非蛋白氮来干扰凯氏定氮法测定牛奶蛋白含量，达到以假乱真以次 充好的目的．近年来，国内外多次发生牛奶掺假事件．特别是２００８年我国发生了国产奶粉中大规模地检测出 三聚氰铵的毒奶粉事件，这一以非蛋白（三聚氰铵）充当蛋白的掺假行为使人们的健康受到严重影响，也显 现出了传统的牛奶蛋白定量检测方法（凯氏定氮法）的种种缺陷和不足．为了进一步探索非蛋白氮对凯氏定 氮法的影响程度，本实验特意对尿素、氯化铵、碳酸铵３种含氮物质对凯氏定氮法测定牛奶蛋白含量的干扰 进行专门的研究和探讨． 目前，国内外对凯氏定氮法的研究比较多，对凯氏定氮法测定食物蛋白时的干扰因素也比较关注［６ 。。， 但大多集中在通过改良凯氏定氦法… 和用其他蛋白质测定方法代替凯氏定氮法从而避免干扰物质对凯 氏定氮法的影响这两方面．例如主张用红外技术 代替凯氏定氮法或用三氯乙酸¨ 处理样品，让真正的蛋 白质形成沉淀，过滤后，分别测定沉淀和滤液中的氮含量，从而测定蛋白质的真正含量和冒充蛋白质的氮含 量．而事实上对凯氏定氮法测定食物蛋白时的干扰因素的深入研究很少，目前尚未见到针对尿素、氯化铵、碳 酸铵等含氮物质在凯氏定氮法测定牛奶蛋白含量时的干扰程度，在本实验之前，非蛋白质含氮物质已被确认 为凯氏定氮法测定食物蛋白含量的干扰因素，因此本文的研究着重探讨尿素、氯化铵、碳酸铵含氮物质对凯 氏定氮法测定牛奶蛋白含量具有明显的干扰作用及干扰作用的强度． １材料与方法 １．１仪器与试剂 紫外分光光度计：２ １００ ｐｒｏ型（北京瑞利分析仪器公司）、微量凯氏定氮仪． 所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制．硫酸铜、硫酸钾、硫酸、４０ ｇ／Ｌ硼酸吸收液（２０ ｇ硼酸溶解于５００ ｍＬ热蒸馏水中）、过氧化氢溶液（体积分数为３０％），氢氧化钠溶液（质量比为４００／１ ０００；称取４００ ｇ氢氧化 钠，用１ ０００ ｍＬ水溶解，待冷却后移入试剂瓶中）、甲基红一漠甲酚绿混合指示剂（用体积分数为９５％的乙 醇将澳甲酚绿及甲基红分别配成１ ｇ＇Ｌ韵乙醇溶液，使用时按１ ｇ／Ｌ澳甲酚绿与１ ｇ／Ｌ甲基红的体积比为５ ：１的比例混合）、０．１ ｍｏｌ／Ｌ硫酸（或盐酸）标准溶液． 牛奶样品溶液：来源当地超市的伊利２５０ ｍＬ纯牛奶（批号：Ｄ１０２０９Ｅ１２０３） １．２实验方法 １．２．１ 牛奶稀释样品及尿素等干扰样品的配制 取０．１ ｍＬ牛奶原品，用二次蒸馏水定容到５ ｍＬ，得５０倍 稀释样品，从５ ｍＬ的５０倍稀释样品中取２．５ ｍＬ再次定容到５ ｍＬ，得１００倍稀释样品．从１００倍牛奶稀释样 品中各取０．１ ｍＬ于６管试管中，分别加人干扰品（尿素或氯化铵或碳酸铵）配制成０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、 ６．０ ｍｏｌ的干扰品． １．２．２牛奶稀释样品中蛋白浓度的测定用微量凯氏定氮仪测定５０倍、１００倍牛奶稀释样品中的蛋白含 量，分别取１ ｍＬ的５Ｏ倍、１００倍牛奶稀释样品于８管消化管中，蒸发至干．然后依次向各消化管中加入硫酸 铜与硫酸钾（体积比为４：１００）的混合２００ ｍｇ、硫酸５ ｍＬ及数粒玻璃珠至于电炉上缓慢加热消化，注意防止 溶液沸腾．再将消化液用定氮仪蒸馏，蒸馏步骤为：在各消化液中加入适量的３０％ＮａＯＨ溶液开始蒸馏（用蒸 馏水做空白液），反应出来的氨用硼酸溶液吸收，蒸馏液用０．０１ ｍｏｌ／Ｌ的盐酸滴定（采用微量滴定管），计算 出含氮量．将含氮量乘以６．２５换算成蛋白质的含量． １．２．３ 牛奶干扰样品中蛋白浓度的测定方法同牛奶稀释样品中蛋白浓度的测定，分别测定加入不同种类 和浓度干扰物后（尿素／氯化铵／碳酸铵），５Ｏ倍、１００倍稀释牛奶的蛋白浓度． １．２．４微量凯氏定氮法的测定步骤分别取１ ｍＬ的５Ｏ倍、１００倍牛奶稀释样品和不同尿素浓度的干扰样 品于８管消化管中，蒸发至干．然后依次向各消化管中加入硫酸铜与硫酸钾（体积比为４：１００）的混合物２００ ｍｇ、硫酸５ ｍＬ及数粒玻璃珠置于电炉上缓慢加热消化，注意防止溶液沸腾．再将消化液用定氮仪蒸馏，蒸馏 步骤为：在各消化液中加入适量的３０％ＮａＯＨ溶液开始蒸馏（用蒸馏水做空白液），反应出来的氨用硼酸溶 液吸收，蒸馏液用０．０１ ｍｏｌ／Ｌ的盐酸滴定（采用微量滴定管），计算出含氮量．将含氮量乘以６．２５换算成蛋 湖南师范大学自然科学学报 第３３卷 白质的含量． ２结果与分析 ２．１牛奶稀释样品中蛋白浓度的测定 用微量凯氏定氮法测定５Ｏ倍、１００倍稀释样品的浓度．测定结果见表１．根据表１中微量凯氏定氮法测 定的５Ｏ倍牛奶稀释样品的蛋白含量数据，计算出６个５Ｏ倍牛奶稀释样品平均值＝８０１．７ ｕ￣／ｍＬ，标准差＝ ７．３２ ｕｇ／ｍＬ，ＣＶ（变异系数）＝Ｏ．９１％．同理，根据微量凯氏定氮法测定的１００倍牛奶稀释样品的数据，计算 出平均值＝３７７．５ ｕｇ／ｍＬ，标准差＝３．８６ ｕｇ／ｍＬ，ＣＶ（变异系数）＝１．０２％，由此可见，在没有任何干扰物质存 在的条件下，用微量凯氏定氮法测定牛奶蛋白含量，重现性较好，变异程度较小，精密度较高． 表１微量凯氏定氮法测定牛奶稀释样品结果 ２．２牛奶干扰样品中蛋白浓度的测定 用微量凯氏定氮法分别测定加人不同干扰物（尿素／氯化铵／碳酸铵）的１ ｍＬ ５０倍、１００倍稀释牛奶的 蛋白含量，结果分别见表２—４． 以原各稀释样品中测得的蛋白浓度为标准，根据表２中微量凯氏定氮法测定的加入尿素干扰物的５Ｏ倍 牛奶蛋白含量数据，计算相对标准偏差（ＲＳＤ），分别为３．０９、４．９８、６．５６、９．２８、ｌ１．５５、１４．４，均大于２％；同 理，根据微量凯氏定氮法测定的加入尿素干扰物的１００倍牛奶稀释样品蛋白含量数据，计算其ＲＳＤ分别为 ２．７３、５．６２、７．６０、１３．０６、２１．４８、３１．９５，均大于２％，由此可见，在加入尿素时，用微量凯氏定氮法测定牛奶蛋 白含量，其结果明显受到干扰，精密度差． 以原各稀释样品中的测得的蛋白浓度为标准，根据表３中微量凯氏定氮法测定的加人氯化铵干扰物的 ５０倍牛奶稀释样品蛋白含量数据，计算ＲＳＤ分别为２．２２、２．６８、４．Ｏ７、７．２０、９．３３、１１．６，均大于２％；同理，根 据微量凯氏定氮法测定的加入干氯化铵干扰物的１００倍牛奶稀释样品蛋白含量数据，计算其ＲＳＤ分别为 ２．６２、５．６２、７．３４、１３．８３、２０．９２、３３．４０，均大于２％，由此可见，在氯化铵干扰物存在的条件下，明显影响微量 凯氏定氮法测定牛奶蛋白含浓度的准确性，精密度也差． 根据表４中微量凯氏定氮法测定的加入碳酸铵干扰物的５０倍牛奶稀释样品蛋白含量数据，计算得出 ＲＳＤ分别为２．５４、３．８３、５．４８、７．８０、ｌ０．３７、１２．８０，均大于２％；同理，根据微量凯氏定氮法测定的加入碳 酸铵干扰物的１００倍牛奶稀释样品蛋白含量数据，计算其ＲＳＤ分别３．１８、６．４１、９．２２、１５．５２、２１．１１、 ２９．４６，也均大于２％，由此可见，在碳酸铵存在的干扰物条件下，用微量凯氏定氮法测定牛奶蛋白含量准确性不好． 表２微量凯氏定氮法测定尿素干扰样品结果 第ｌ期 袁炳秋等：尿素、氯化铰、碳酸铰对牛奶样品微量凯氏定氮法的干扰 ６９ Ｏ．５ ８１９．５ Ｏ．５ ３８７．４ ２．６２ １．０ ８２３．５ ’加入氯化铵 ６８ 加入氯化铵 １．０ ３９８．７ ５．６２ ２．０ ８３４．３ 铵００ ２．Ｏ ４Ｉ ．２ ７．３４ 干扰物的５Ｏ ：．０７ ３．０ ８５９．４ ．２０ ３．Ｏ ，１．２９．７ 倍稀释样品 ｌ３．８３ 品 ４．０ ８７６．５ ４．０ ４５４．１ ２０．９２ ６．Ｏ ８９４．７ ６．Ｏ ５０３．６ ３３．４０ 原５ｏ倍稀释 品中蛋白浓度平 ８ｏ１．７ 原ｌ０ｏ倍稀释样品中蛋白浓度 ７７．．５ 均值／ｕｇ·ｍＬ 平均值几ｇ·ｍＬ ０．５ ８２２．１ ０．５ ３８９．５ ３．１８ １．Ｏ ８３２．４ ４８３８辈 加入碳酸铵 惹 １．０ ４ＪＤ１．７ ６．４１ 加入碳酸铵 ２．０ ８４５．６ ２．Ｏ ４１２．３ ９．２２ 干扰物的５Ｏ １‘３．Ｏ ８６４．２ ３．Ｏ ４３６．１ １５．５２ 倍稀释样 品 ４．０ ８８４．８ ． ４．０ ４５７．２ ２１．１ｌ ６．０ ９０４．３ ６．Ｏ ４８８．７ ２９．４６ 原５Ｏ倍稀释样品中蛋白浓度平 原１００倍稀释样品中蛋白浓度 ８０１．７ ３７７．５ 均值／ｕｇ·ｍＬ 平均值／ｕｇ·ｍＬ ２．３微量凯氏定氮法测定牛奶稀释样品中蛋白浓度与干扰样品蛋白浓度比较 在表５～７的比较中，加入各浓度的不同种类干扰物质前后，相对误差随干扰物的浓度增加而不断增大； 其中，１００倍稀释牛奶样品的相对误差均在４．０６％一３２．０５％，５０倍稀释牛奶样品相对误差范围在０．９９％一 １４．４６％，显著小于１００倍稀释样品的相对误差；其次，从表５—７的比较结果可以看出，在加人稀释牛奶样品 的３种干扰物中，加入尿素的一组相对误差最大，加入氯化铵的一组相对误差相比最小，加入碳酸铵的一组 相对误差居中． ’ 表５微量凯氏定氮法测定牛奶稀释样品与尿素干扰样品比较 ７０ 湖南师范大学自然科学学报 表６微量凯氏定氮法测定牛奶稀释样品与氯化铵干扰样品比较 第３３卷 ３讨论 微量凯氏定氮法的精确性和可重复性已经得到了国际的普遍认可，被广泛用于检测食品中蛋白质含量． 本试验首先使用凯氏定氮法分别测定牛奶样品的不同浓度稀释品中的蛋白浓度，表１的结果显示５Ｏ倍和 １００倍稀释样品中蛋白质浓度的变异系数分别为０．９１％、１．０２％，表明微量凯氏定氮法在测定牛奶样品中的 蛋白含量稳定性好．在测定加入不同干扰物（尿素／氯化铵／碳酸铵）的５Ｏ倍、１００倍稀释牛奶的蛋白含量时， 由表２、表３、表４结果显示其相对平均偏差均大于１％，相对标准偏差均大于２％，表明微量凯氏定氮法在测 定加入不同干扰物的５Ｏ倍、１００倍稀释牛奶的蛋白含量时，重现性差，精密度也差，并且所测定的加入干扰 物质的１００倍稀释比５Ｏ倍稀释牛奶牛奶的蛋白含量的准确性要差，这可能是因为相同量的干扰物质对相对 稀释牛奶样品的蛋白含量影响更明显，因为相同量的干扰物质在相对稀释牛奶样品中相对较多，所占的分量 较大．另外，凯式定氮法得到的尿素干扰牛奶样品中蛋白含量最高且误差最大的这一现象，这可能和加入牛 奶样品中的不同干扰物的含氮量相关，尿素的含氮量为４６．７％，碳酸铵含氮量为２９．２％，氯化铵含氮量为 ２６．２％，尿素中含量相对较高的非蛋白氮对微量凯氏定氮法的干扰也最明显，以至在加入稀释牛奶样品的３ 种干扰物中，加人尿素的一组相对误差最大．本实验在加入稀释牛奶样品的同一种干扰物中，随着加入的干 扰物的量逐渐增加，干扰物对微量凯氏定氮法测定牛奶蛋白含量的干扰越明显，产生的相对误差也逐渐增 大．例如在表５中，随着加人尿素干扰物的量逐渐增加，两种不同稀释度样品的相对误差分别从１．８６％增加 到１４．４６％，从４．１６％增加到３２．０５％．总之，干扰物质中的非蛋白氮对微量凯氏定氮法测定牛奶蛋白含量有 干扰，非蛋白氮含量越多，干扰越明显． （下转第１２８页）
尿素、氯化铵、碳酸铵对牛奶样品微量凯氏定氮法的干扰
