水污染生物学实验
一. 实验目的
1. 了解水体富营养化评价方法，并通过对单一因子指标的测定，对模拟水体的富营养化程度进行评价。
2. 回顾水体单一污染因子测定方法，包括透明度(SD)、总磷(TP)、总氮(TN) 和高锰酸盐指数(CODMn)。
3. 掌握叶绿素Chla、 TN、 TP的测定方法，熟悉实验程序，了解各种仪器的工作原理和操作方法。
二．实验原理
1. 叶绿素a的测定原理
叶绿素a存在于所有植物中，约占有机物干重的 1%～2%，是水体初级生产力和估算水体中浮游植物浓度的重要指标，对叶绿素a进行测定，可以了解水体的生产力和富营养化水平。
叶绿素不溶于水，但溶于乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂。叶绿素a和b，分别在蓝紫光区和红光区对光谱有两个吸收峰。因此，可以应用有机溶剂提取叶绿素，在特定波长下进行比色测定。
2.TN的测定原理--碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法
总氮：指可溶性及悬浮颗粒中的含氮量。
在60℃以上水溶液中，过硫酸钾可分解产生硫酸氢钾和原子态氧，硫酸氢钾在溶液中离解而产生氢离子，故在氢氧化钠的碱性介质中可促使分解过程趋于完全。分解出的原子态氧在120～124℃条件下，可使水样中含氯化合物的氮元素转化为硝酸盐。并且在此过程中有机
物同时被氧化分解。可用紫外分光光度法于波长220和275nm处，分别测出吸光度A220及A275按公式求出校正吸光度A： A＝A220－2A275……………………(1)
按A的值查校准曲线并计算总氮(以NO3－N计)含量。
3. TP的测定原理
总磷是指水体中各种形态的磷的总量，是反映水体所受污染程度和湖库水体富营养化程度的重要指标之一。
本实验采用过硫酸钾高温高压消解法进行预处理,使其中的含磷有机物转化成可溶的磷酸盐,同时也使偏磷酸盐和焦磷酸盐都转化成正磷酸盐，然后于波长700nm处测定吸光度，从标准曲线上查出含磷量。
三．实验仪器
紫外分光光度计，高压蒸汽消毒器，10ml、25ml、50ml具塞玻璃磨口比色管，抽滤器，离心机。
四．实验试剂
1. 测定叶绿素a：碳酸镁，90%乙醇。
2. 测定TN: 无氨水，20%NaOH溶液，碱性过硫酸钾溶液，硝酸钾标准溶液，（1+9）盐酸。
3. 测定TP: （1+1）硫酸，10%抗坏血酸溶液，钼酸盐溶液，磷酸盐标准溶液。
五．实验步骤
1.叶绿素a的测定
（1） 水样采集后放在阴凉处，避免日光直射，最好立即进行测定的预处理。如需经过一段时间 (4～48h) 才能进行预处理，则应将水样保存在低温避光处，在每升水样中加入1ml 1% 的碳酸镁悬浊液，以防止酸化引起色素溶解。
（2） 在抽滤器上装好0.45μm醋酸纤维滤膜，倒入定量体积的水样进行抽滤，抽滤时负压不能过大 (约50kPa)。水样抽完后，继续抽1～2min，以减少滤膜上的水分。
（3） 抽滤完毕后， 将带有浮游植物的滤膜直接放入 10ml 比色管中(即不干燥研磨)，加入少量的碳酸镁粉末，再加入 90% 乙醇 10ml，在常温暗室中提取6～8h。
（4） 取出，充分摇匀比色管内含物，用3500r /min 离心10min，上清液再转入比色管中，用 90% 的乙醇定容至 10ml。
（5） 用分光度度计在750nm、663nm、 645nm、630nm 波长处，分别测定其吸光度值，并以90%的乙醇作空白吸光度测定。 2.TN的测定
（1）标准曲线的绘制
①分别吸取0、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00、7.00、8.00ml硝酸钾标准使用溶液于25ml比色管中，用无氨水稀释至10ml标线。 ②加入5ml碱性过流酸价溶液，塞紧磨口塞，用纱布及纱绳裹紧管塞，以防迸溅出。
③将比色管至于压力蒸汽消毒器中，加热0.5h，放气使压力指针回零，然后升温至120-124℃开始计时，使比色管在过热水蒸气中加热
0.5h。
④自然冷却，开阀放气，移去外盖，取出比色管并冷却至室温。 ⑤加入（1+9）盐酸1ml，用无氨水稀释至25ml。
⑥在紫外分光光度计上，以无氨水做参比，用10mm石英比色皿分别在波长220nm及275nm处测定吸光度。用校正的吸光度绘制标准曲线。
（2）样品测定步骤
取10ml水样，按标准曲线绘制步骤②至⑥操作。然后按校正吸光度，在标准曲线上查出相应的总氮量，在用下列公式计算总氮含量。 总氮(mg/l)=m/V 式中：m--从标准曲线上查的含氮量（μg）； V--所取水样体积（ml）。 3.TP的测定
（1）标准曲线的绘制
①取数支50ml具塞比色管，分别加入磷酸盐标准使用液0、0.50、1.00、3.00、5.00、10.00、15.00ml，加水至50ml。
②消解：向比色管中加入4ml过硫酸钾溶液，加塞后管口包一小块纱布并用线扎紧，将具塞刻度管放在大烧杯中，至于高压蒸汽消毒器，待锅内压力达1.1kg/cm2时，保持此压力30min后，停止加热，待压力标指针降至零后，取出放冷。
③显色：向比色管中加入1ml 10%抗坏血酸溶液，混匀。30s后加2ml.钼酸盐溶液充分混匀，防止15min。
④测量：用10mm或30mm比色皿，于700nm波长处，以零浓度溶液做参比，测量吸光度。 （2）样品测定
分别取适量经消解的水样50ml比色管中，用手稀释至标线。一下按绘制标准曲线的步骤进行显色和测量。减去空白试验的吸光度，并从标准曲线上查出含磷量。
六．数据处理 1.原始数据
（1）叶绿素a：750nm：-0.011，-0.010，-0.009,平均：-0.01 663nm：0.005,0.013,0.002， 平均：0.0067 645nm：-0.001,0.002,0.001 平均：0.00067 630nm: -0.001,0.005,0.001 平均：0.0017 (2)TN: 220nm: 6.549; 275nm:0.627 (3)TP: 700nm: 0.170,0.172,0.194 2.处理结果 (1)叶绿素a(mg/m3)
=[11.64(D663-D750)-2.16(D645-D750)+0.10 (D630-D750)] ·V1/(V·δ)
=[11.64(0.0067-（-0.01））-2.16（0.00067-(-0.01)）+0.1(0.0017-(-0.01))
水体富营养化评价试验
