补肾活血中药促成骨增殖靶效应抗骨质疏松的机制研究
林松青1，王 彬1，周 洁2，陈 宇1，范世珍1 【期刊名称】中国实验诊断学 【年(卷),期】2017(021)008 【总页数】4
骨质疏松症(OP)是临床中常常遇见的骨疾病,是引起全身骨量降低的主要因素,进而导致骨微结构毁坏以及骨密度降低,增加骨脆性因而易于发生骨折[1]，严重者甚至威胁生命。目前西医临床用于治疗骨质疏松症的药物主要有雌激素、降钙素以及阿伦磷酸盐等药物，其临床疗效尚可，但副作用也多。研究表明[2]，人们随着年龄的增加，胃肠道、肝肾功能也随之衰退，老年人长期用药后容易导致药物在体内蓄积，副作用明显增大，且对治疗骨质疏松的疗效明显降低。中医治疗骨质疏松症主要从“肾主骨”论治，辅以活血，能够明显的缓解骨质疏松患者的临床症状及生活质量的提高。研究表明，补肾活血中药通过加快成骨细胞的增殖分化进而增快骨形成，但中药促进成骨，抑制骨吸收的效应与机制尚不完全清楚，研究发现NF-κB信号通路是其作用的重要靶点。NF-κB信号通路在成骨细胞分化、增殖及凋亡中有着关键的作用，同时还能介导骨组织的生长发育。本实验通过体外实验来分析NF-κB信号通路在补肾活血中药抑制骨吸收、促进骨形成过程中的作用机制，探讨NF-κB信号通路相关基因成骨分化的分子功能，从细胞分子学角度分析补肾活血中药防治骨质疏松症的科学依据及作用机理。
1 材料与方法
1.1 材料 补肾活血方(主要成分为补骨脂、熟地、黄芪、山茱萸、当归)的提取
药物，最后提炼制成中药冻干粉(康美药业公司提供)。成骨细胞由SD大鼠头盖骨分离培养；破骨细胞由四肢骨分离培养。 1.2 方法
1.2.1 成骨细胞的分离与培养 取一日龄SD大鼠麻醉下处死,以75%酒精浸泡15 min,取出头盖骨,以DMEM洗净、剪为1立方毫米大小的骨块,接着将附着软组织剔净,获取其细胞,再用PBS缓冲液冲洗,放于NCS-MEM培养液中培养,培养液浓度为10%。接着静置培养于37℃ 5%CO2中,时间间隔2天换1次培养液,弃去原培养液,然后于胎牛血清MEM中开始培育,培养液浓度为10%。直到单层细胞铺满培养瓶底,时间通常为4-7天。观察到细胞开始传代时,先把原培养液倒掉,然后选用D-Hank’s液对培养的细胞进行冲刷,消化选用0.25%胰蛋白酶,倒掉消化液后再倒入培养液,接着对培养瓶底进行吹打,促使细胞脱落,从而制成细胞悬液,最后接种于新的培养瓶,放置于37℃、5%CO2中静置继续培育。 1.2.2 破骨细胞的分离与培养 麻醉下取SD大鼠的四肢长骨,然后冲洗大鼠骨髓,过80目筛，移于试管中，加培养液混匀，取下2/3的培养液，用10%牛血清培养液培养，3 h后更换培养液， 2 d后再次更换培养液，持续培养。
1.2.3 成骨细胞-破骨细胞共育体系的创设 先对破骨细胞进行细胞计数,再对成骨细胞计数,用培养液调整成骨细胞数,使成骨细胞和破骨细胞数目之比为10∶1、100∶1,将其种植于24孔板中,用含有1mM的B-甘油磷酸钠培养细胞6h后,取成功培育的破骨细胞和成骨细胞进行贴面培养,收集成骨细胞,对细胞碱性磷酸酶的含量及活性进行检测并对细胞碱性磷酸酶染色。。
1.2.4 药物制备 用煎煮法以水为溶剂提取中药配方的有用成分，最后得到药材重量：中药水提液=1∶1～1∶1.5，冷却后，往水提液中一边放入无水乙醇一
边搅拌至乙醇浓度为 50%-60%，静置6 h。抽滤，弃去沉淀，将滤液蒸发浓缩至稠膏状，真空干燥，得冻干粉。DMEM 培养基稀释成母液，放入培养基中干预细胞。
1.2.5 实验分组 按照细胞生长情况换补肾活血中药血清培养液；实验分A 组(诱导剂+中药血清低浓度组 50 μg/ml)、B 组(诱导剂+中药血清中浓度组100 μg/ml)、C组(诱导剂+中药血清高浓度组 200 μg/ml)、D组(空白对照组，培养液为完全培养基)、E组(诱导剂组：完全培养基加入地塞米松、维生素C、甘油磷酸)、F组(NF-kB信号通路的特异性抑制剂IKK-DN 组)。
1.2.6 DAPI染色法检测细胞凋亡 把用0.25%胰蛋白酶消化后的细胞分别放入10%含药血清培养7天,放入TNF-α,分别于12 h、24 h后选出长有成骨细胞的盖玻片,投入95%酒精固定15-30 min,微干,染色1 min。0.1M CaCl2处理2 min。用PBS漂洗几次,每次漂洗时间一般为持续3秒。紧接着用PBS封片,放置于Nikon荧光显微镜下直接观察并照相。
1.2.7 ELISA 法检测培养液中RANK浓度 干预培养48 h取培养液。每孔分别放入样品、样品稀释液，标准品各100 μl,37℃温育30 min后分别放入酶标偶合液、底物、终止液50 μl于450 nm波长读取OD值。样品、标准品均设复孔，每个样本重复1次。 1.3 统计学分析
采用SPSS19.0软件处理,以±s)描述实验数据,对于正态分布定量数据多组间均值比较,采取单因素方差分析法,两两均数比较,采用LSD法分析,方差齐性检验用Levene法。以P<0.05为有统计学差异，P<0.01为有非常显著差异。
2 结果
补肾活血中药促成骨增殖靶效应抗骨质疏松的机制研究
