毕业论文文献综述
生物技术
禽呼肠孤病毒形态的早期步骤
摘要：禽呼肠孤病毒是主要的病原体，可能导致家禽养殖中巨大的经济损失。它们的基因组至少表达了八种结构蛋白和四种非结构蛋白，其中三种是由S1基因编码的。这些病毒通过受体介导的内吞作用进入细胞，病毒包含的内涵体的酸化对病毒的脱壳和释放转录活跃的核心到细胞质是必需的。禽呼肠孤病毒的复制在被称为病毒工厂的球形形态的细胞内含物中进行，它与微管无关，是由非结构蛋白μNS形成的。这种蛋白也介导一些病毒蛋白（但有些则没有）与内含物的结合，这表明病毒蛋白的招募进入禽呼肠孤病毒工厂是具有特异性的。禽呼肠孤病毒的形态是一个复杂的过程和时间控制的只发生在感染细胞的病毒工厂内。核心装配发生在它们蛋白部件合成之后的最初30分钟里，完全形成核心然后包覆外层衣壳蛋白多肽，在下一个30分钟将产生成熟的传染性的新病毒颗粒。根据从禽呼肠孤病毒的数据和呼肠孤病毒科家族的其它成员所报道的结果的研究，我们提出了一个关于禽呼肠孤病毒基因表达和形态发生的模型。 关键词：呼肠孤病毒；病毒工厂；非结构蛋白μNS
禽流感和哺乳动物的呼肠孤病毒组成了正呼肠孤病毒属两个主要的种群，是呼肠孤病毒科家族12个成员之一[1]。虽然这些呼肠孤病毒在结构和分子组成上非常相似[2,3]，但是这两个组群的成员在宿主范围、致病性的程度和基因编码能力方面存在不同，在病毒的生化特性方面也不同[4]。只有禽呼肠孤病毒诱导感染细胞中合胞体的形成，而只有哺乳动物呼肠孤病毒能诱导红细胞凝集[5,6]。
鸟类的呼肠孤病毒在禽类中很普及，但是其传染性通常是无症状的，并且从鸟中分离出来的大多数呼肠孤病毒是非致病性的。在病毒和疾病之间的直接联系存在的仅仅是最后才表明患有病毒性关节炎综合症和腱鞘炎，通过踝关节连接处的肿胀和腓肠肌筋的病变特征表现出来[7,8]。根据对细胞附着蛋白σC的序列系统发育分析，编码禽呼肠孤病毒组有五种不同的基因簇。然而，在特定的基因型和疾病症状中分离出来的病毒之间没有相关性可以被建立[9]。而且，到目前为止，所有按照病毒血清学特征把禽呼肠孤病毒进行分类的尝试都没有成功。因为这些病毒显示了高度的抗原异质性，而在中和测试中表现出相当大的交叉效应。
禽呼肠孤病毒拥有由十段双链RNA组成的基因组包裹在二十面体对称的无包被双层蛋白衣壳之中。至少有十种不同的结构多肽存在于禽呼肠孤病毒中，它们分布于病毒
颗粒里如图1所展现[10,11]。禽呼肠孤病毒的结构蛋白在电泳迁移率的反向顺序中已经按字母顺序排列标分配(λA, λB, etc.)，用于区分来自哺乳动物呼肠孤病毒蛋白分配的数值标(λ1, λ2, etc.)。
初始病毒细胞外的附件对于寄主细胞是通过迄今为止还未知的寄主受体，较小的外衣壳蛋白σC的具体作用来调节的[12,13]。禽呼肠孤病毒通过受体调解内吞作用进入宿主细胞（图2），并且病毒含有的内涵体的酸化对禽呼肠孤病毒在感染细胞中的脱壳和复制是必需的[14,15]。病毒的脱壳被认为便于膜的相互作用，对释放有能力转录的禽呼肠孤病毒核心进入细胞质是必需的。
图.1A-C 禽呼肠孤病毒S1133基因组片段（A）和原始转录产物（B）的电泳分析。.哺乳动物呼肠孤病毒同源多肽用数值命名法在括号内被表示。C 处是禽呼肠孤病毒的图解，指出了结构多肽的位置。
图.2 电子显微镜显示了禽呼肠孤病毒渗透进入禽细胞的过程。把纯化的禽呼肠孤病毒添加到鸡胚单层培养的成纤维细胞内，在4℃下孵化1小时，接着将细胞放在37℃下孵化一段时间显示在上面，经固定后在电子显微镜下观察分析。
细胞内病毒的转录是被一个核心结合的双链RNA依赖的RNA聚合酶所催化，产生病毒mRNA与它们编码基因的正链相同，在5丿端具有类型1的帽子结构，缺少3丿的Poly（A）尾巴[16]。呼肠孤病毒的mRNA在感染细胞中发挥着双重作用，它们在核糖体上进行着病
毒蛋白的合成，并且与它有联系的负链的产生作为模板，因此产生后代双链RNA基因组片段。每一个禽呼肠孤病毒的多肽是由相同的基因所编码的，在体外的翻译是由单个基因组片段变性所决定的(图.1)。虽然大多数禽流感呼肠孤病毒基因组片段以单顺反子出现，在感染细胞内S1片段三顺反子基因的功能是表达两种非结构蛋白(p10 和p17)和一种结构蛋白(σC) (图.1)[17]。两种其他的非结构蛋白μNS和σNS是由M3和S4基因组片段分别编码的，一个氨基酸改变了μNS的亚型，被称为μNSC，最近表明在禽呼肠孤病毒感染细胞中产生[18]。
禽呼肠孤病毒M2基因的主要翻译产物是μB蛋白，在细胞内被十四烷酰化，蛋白酶解。μB的特定位点的分裂产生一个十四烷基的N-末端肽μBN和一个巨大的C-末端蛋白μBC，两者的前体和分裂产物是呼肠孤病毒的结构组成[19]。最近表明，非结构蛋白P10的棕榈酰化以胱氨酸模式保存在膜近端，并且这种共价修饰的出现对于这种蛋白的膜融合活动是必需的[20]。所有禽呼肠孤病毒感染细胞的蛋白，除了σA之外可能是λB 出现了糖基化，虽然发生的糖基化程度很低。 1. 病毒性工厂
关于呼肠孤病毒科家族的不同成员一定数量的早期研究结果显示，这些在细胞质内复制和装配的阶段凝集成不等的内含物被称为病内含物、病毒工厂或者病毒形成圈。这些特定的结构包括结构蛋白和非结构蛋白，也包括病毒双链RNA和部分或全部装配的病毒颗粒，但是缺少膜和细胞器，包括核糖体。它们首先是以许多小颗粒遍布分散出现在在细胞质，当进一步侵染时，它们变大，数量减少，核周分布[21-23]。呼肠孤病毒工厂的成因和组成，也在病毒生活周期中它们起作用，只是刚开始被鉴定。
感染禽呼肠孤病毒的细胞同样被发现包含大量的细胞质阶段凝集内含物位于病毒复制和装配的位点[24,25]。大量的核周内含物的次晶排列主要包含完整的病毒和空载的病毒颗粒，在禽呼肠孤病毒感染细胞的超薄切片的电子显微镜下观察到。感染细胞和免疫荧光电镜分析进一步显示了禽呼肠孤病毒工厂是球状形态的离散结构，没有微管相连
[18]
。在感染期间，球形工厂同样产生类型3的哺乳动物呼肠孤病毒种系T3DN 和
T3C12[26]。相比大多数哺乳动物呼肠孤病毒种系形成的微管结合工厂，其丝状特性的出现是由核心蛋白μ2的容量所决定的，并与微管相互作用，一起锚定于病毒工厂[27]。这些结果表明，像哺乳动物呼肠孤病毒T3DN 和 T3C12所对应的μ2一样，禽呼肠孤病毒μA并没有与丝状微管结合，虽然这个假说和假定μA–μNS的联系有待实验证实。 一些禽呼肠孤病毒蛋白在侵染细胞内的分布与转导细胞的对比分析表明，虽然所有这些蛋白都出现在侵染细胞的病毒工厂内，而在转导细胞内单独表达时只有M3编码的
非结构蛋白μNS位于细胞质球形内含物内(图. 3, panel 1A)。这个结果表明μNS是最小的病毒因子需要在感染细胞的工厂里形成，工厂的矩阵是μNS的主要组成部分。像禽呼肠孤病毒蛋白μNS，呼肠孤病毒科家族的其它成员的一些非结构蛋白也被报道说在缺少其他病毒部件时能诱导病毒形成圈样结构的形成。例如：在细胞侵染时，病毒内含物的形成与重组杆状病毒表达蓝舌病毒非结构蛋白μNS，并且在细胞中与轮状病毒的非结构蛋白NSP5和NSP2的共转移或与哺乳动物呼肠孤病毒蛋白μNS的转移有关[28 ,29]。
禽呼肠孤病毒μNS的包涵体形成的能力表明通过启动病毒复制的位点，这些蛋白在
禽呼肠孤病毒生活周期的早期阶段起重要作用。μNS蛋白也是主要的候选物为招募结构蛋白到病毒工厂也为随后装配进入病毒粒子。转染细胞表达μNS和各种其它病毒蛋白的检测表明，当与μNS结合表达时，只有λA和σNS再分配到球形内含物内(图. 3)。这些结果与观察到λA和σNS出现在病毒工厂的侵染细胞内表明，μNS调节这两种蛋白选择性招募进入禽呼肠孤病毒侵染细胞的工厂里。而且在三重转染细胞实验显示，μNS招募λA进入内含物的能力是不能被σNS的表达所抑制。这个发现结合观察到λA和σNS两者出现在单个μNS内含物内，并且这两种蛋白的结合对于区分μNS位点表明λA和σNS通过与相同的μNS分子非竞争性的相互作用后被招募到病毒工厂。与λA和σNS相比，细胞内核心蛋白σA和外衣壳蛋白σC的分布不受μNS共表达的影响(图. 3)表明，它们两者通过μNS依赖的机制穿梭进入工厂，并且它们并不需要工厂形成的开始步骤。集合这些数据表明，病毒蛋白的招募进入禽呼肠孤病毒工厂是一个选择性和暂时控制的过程，它确定病毒蛋白通过与μNS联系在一开始就穿梭到工厂。而其它的招募者通过与到目前为止还未知的因素的相互作用。据报道与禽呼肠孤病毒位置相比，每一个哺乳动物呼肠孤病毒核心蛋白λ1, λ2, 和σ2独立的被招募到转染细胞μNS的内含物，表明三种核心蛋白通过与μNS特定的结合穿梭进入哺乳动物呼肠孤病毒的工厂[30]。因此，禽流感和哺乳动物呼肠孤病毒的出现使用不同的机制为招募它们的同源核心蛋白σA和σ2到它们各自的病毒工厂。有可能的是所有禽呼肠孤病毒基因的克隆和表达将能够识别所有病毒，它的工厂招募是μNS依赖的和病毒因素涉及μNS依赖的其它结构病毒蛋白的招募。这个信息可以用来了解蛋白团进入工厂和病毒颗粒的时间进程。 2. 核心装配
禽呼肠孤病毒核心装配需要用协调的方式把蛋白质的部件结合在一起，十个病毒mRNA的每一个拷贝是选择性和用壳体包裹的，并且这些mRNA随后用作互补链合成的模板，为了再生出全部十个双链RNA基因组片段。
虽然免疫荧光电镜已经成功的用于监测转染细胞中呼肠孤病毒蛋白与μNS内含物
的联系。个体蛋白招募进入侵染细胞的病毒工厂和病毒粒子内不能够直接被免疫化学技术检测，因为抗体不能区分空载和包含体相关蛋白。为了克服这个问题，设计了一个实验方法，把代谢脉冲追逐放射性标记与细胞分馏和抗体免疫沉淀结合起来。区分这种途径的能力是基于Triton X-100抑制裂解缓冲液的能力，以前用于区分可溶性和细胞骨架联系的呼肠孤病毒蛋白[31]，溶解的自由蛋白可广泛分布在整个胞浆，而内含物相关蛋白能保持抵抗缓冲液的提取(图. 4A)，这个结合途径的结果显示，μNS是最近合成的病毒多肽，只与不溶性部分有联系(图. 4B)，表明，当μNS一合成时就形成球形内含物，并且所有其它病毒蛋白在变成与μNS内含物结合之前在细胞内合成。
核心装配被来自氨基酸35S脉冲追逐细胞的可溶与不溶提取物与单克隆抗体对照核心蛋白σA的免疫沉淀确定(图. 4D)。结果显示，核心装配是一个复杂的和暂时的控制过程，只在病毒工厂内发生。这些数据进一步表明，在这些蛋白质部件的合成之后，核心在开始的30分钟内完全形成。只有当它们完全装配时，外衣壳蛋白团在它们外面产生成熟的呼肠孤病毒。虽然还没有被直接的测试，但核心装配只在病毒工厂内的事实表明，这些结构也是mRNA依赖负链合成的位点。这个假说被最近观察到巨大数量的转录病毒mRNA位于哺乳动物呼肠孤病毒侵染细胞的工厂里所支持。也被最近由Silvestri[32]的研究数据所支持。这个研究的结果表明，在轮状病毒侵染细胞中，有两种不同类型的正链RNA病毒，那些从来没有离开病毒形成圈，它是为负链RNA合成作为主要的模板资源。并且这些超过病毒形成圈的RNA结合能力释放进入细胞质为在核糖体上病毒蛋白合成的过程。他们的结果进一步表明轮状病毒mRNA释放进入细胞质不能够被运输回来进入病毒形成圈，因此，不能够被用作负链合成的模板。
禽呼肠孤病毒形态的早期步骤【文献综述】
