生物化学课件完整版(极其详细)
第二章 蛋白质
第一节 蛋白质的概念及其生物学意义
一、什么就是蛋白质？
α—AA 借肽键相连形成的高分子化合物(短杆菌肽含D-苯丙氨酸) O ［肽键:—C—NH— 也叫酰胺键］
二、蛋白质的生物学作用(或称功能分类)
物质吸收与运输、运动,调节代谢、储存养分、催化各种生化反应、分子间的识别(支架蛋白)、信息传递(受体 复制酶)、记忆、疾病防御 — 抗体。
应用:固体酶的工业应用(联于水不溶性树脂上)、脱(纺织品)浆(淀粉酶)、生化制药,蛋白酶用于皮革的脱毛及软化等,都就是利用蛋白质的催化作用,蛋白质生物芯片(贮存信息量大,将多种蛋白质抗体固定、排列到玻璃板上,能检测各种疾病蛋白及其她基因表达蛋白),进行病原体与疾病诊断等。
第二节 蛋白质的组成
一、蛋白质的元素组成:
C(50-55％)、H(6-8)、O(20-30%)、N(15-18)、S(半胱aa)(0-4%)
有的还含有P(酪蛋白)、Fe、Zn、Mo(钼Fe蛋白)、Cu、I,特别就是含N量都很接近,平均为16% 。所以,测出含N量 × 6、25(100/16 蛋白质系数)即可推测出蛋白质的含量——凯氏定氮。 二、蛋白质的aa组成
通常只有20种,除Pro外均为 α—aa ,除甘氨酸外,都有D、L两种异构体(α—碳原子为不对称碳原子)所以有旋光性。投影式如下:
COOH COOH H2N — C —H H —C —NH2
R R L—α D —α
aa的分类方法: (一)氨基酸的种类
分类一 根据侧链基团R的化学结构分为四类: 第一类 脂肪族aa:侧链就是脂肪烃链
①一氨基一羧基(中性):一氨基一羧基aa中共九种:
H — CH — COOH CH2 — CH — COO CH2 — CH — COO NH2 OH NH+3 SH NH+3 (Gly:G) (Ser:S) (Cys:C)
－－－
CH3 — CH — COO CH3 — CH — CH— COO CH3 — CH — CH — COO
－
－
NH+3 OH NH+3 CH3 NH+ 3 (Ala:A) (Thr:T) (Val:V 支链aa)
－－
CH3 — S — CH2 — CH2 — CH — C?O CH3 — CH — CH2 — CH — ?O?
(Met :M ) NH+3 CH3 NH+3 (Leu aa) : L 支链
－
CH3 — CH2 — CH — CH — COO
第1页 共132页
生物化学课件完整版(极其详细)
CH3 NH+3 (Ile:I支链aa)
②一氨基二羧基aa(酸性)及其酰胺
—
OOC — CH2 — CH — COO OOC — CH2 — CH2 — CH — COO
—
—
—
NH+3 NH+3 (Asp:D) (Glu:E) O O
H2N — C — CH2 — CH — COO H2N — C — CH2 — CH2 — CH — COO
NH+3 NH+3
(Asn:N) (Gln:Q)
—
—
③二氨基一羧基aa(碱性: —NH2＞-COOH)
H3N+ — CH2(CH2)3 — CH — COO H2N — C — NH —(CH2)3— CH — COO
—
—
NH3+ NH2+ NH3+
(Lys:K) (Arg:R)
第二类 芳香族aa(含有苯环的化合物叫做芳香族化合物,有的包括Trp):
— CH2 — CH — COO HO — — +
NH3 (Phe:F) (丙aa取代) (Tyr:Y)
—
CH2 — CH — COO NH+3
COO
—…
—
第三类 杂环aa:
—CH
HC C—CH2 —COO
—
………
— CH — CH — 2
HN+ NH NH+3 N NH+3
CH
(His:H 咪唑基) (Trp :W 吲哚基 苯并吡咯)
—COO— 第四类 脯氨酸,也称杂环亚氨基酸:由Glu还原、环化、再还原形成
四氢吡咯-2-羧酸
NH2+
(Pro:P)
分类二 按侧链R基团的极性(及在pH7左右时的解离状态)分为:
非极性:甘、丙、缬、亮、异亮、苯丙、蛋、脯、色氨酸。
不带电荷:带OH、SH、酰胺基
极性 带负电荷(酸性aa)
带正电荷:Lys、Arg、His (碱性aa) 、 His等电点为7、59
此外在蛋白质代谢中还有鸟aa、瓜aa(尿素循环中)、胱aa、羟脯aa、羟赖aa(胶原蛋白的组分)。甘aa的H介于极性与非极性之间,有时归入极性不带电荷类中。 人与动物的必需aa:不能自身合成必须由食物获得。
Thr、Val、Met、Leu、Ile、Phe、Lys、Trp、His*、Arg* (*半必需aa,儿童合成不足)
第2页 共132页
生物化学课件完整版(极其详细)
(二)aa的性质
1、 物理性质:无色结晶,易容于水,不容于有机溶剂,熔点高( Gly:232℃,乙酸:16、6℃,分子间靠氢键缔合),这些特性说明就是离子化合物。 2、 两性解离及等电点:(难点*)
COO—
加碱解离出H+带负电,加H+结合H+带正电,向阴极移动,
在某一pH下带正、负电荷量相等。
H3N+ —C —H (由很酸向碱变化NH+3— CH —COOH NH+3— CH —COO—
)
R R R
在电场中不移动,此时的pH称为aa的等电点(pI)。此时aa的溶解度最小(因为静电作用),pI与—COOH与—NH2的解离常数有关。
K—
1:—COOH解离为 —COO + H+的解离常数;K2:H3N+解离为 —NH2 + H+的解离常数。其pI可从pK计算或测定(用酸碱滴定法测定)。
aa等电点的计算:
只有一个解离基团的物质AH,其解离常数与pH的关系为pH=pK+lg([A-]/[AH])、证明:
AH A—+H+ K=[A-]*[ H+]/[AH] [ H+]=K*[AH]/ [A-]=K/([A-]/[AH])
-lg[ H+]=-lgk--lg([A-]/[AH]) 即:pH=pK+lg([A-]/[AH])Henderson-方程。当有一半解离时,即 [A-]=[AH]时,pH=pK,即溶液的pH可由其溶质的解离常数与解离量计算而得,溶质的解离常数可查得。 pK:解离常数K的负对数。aa可瞧作二元弱酸(酸性条件)有两个可解离的H+其分步离解如下: K1(+OH－
)
在充分酸的条件下 R—CH—COOH R—CH—COO—
+ H+
NH+3 NH+
3 (R+) (R0) K2
R—CH—COO— R—CH—COO— + H+
NH+
3 NH2
(R0) (R—
) [R 0 + ［R+］= ][H
] ∵K1= [R 0 ][H+]
K1
[R + ]
R0=R+ 时K1=［H+］ [R - ][H K2[R0] + ] K R—
2= =
[R0] [H+] 用NaOH滴定到R0 = R—
时K2 =[H+]
等电点时:aa处于两性离子状态,可有少量解离成阳离子与阴离子,但解离成阳离子与阴离子的数目与趋势相等。即:
[R—
]=[R+] 即 [R0][H+] / K1=K2[R0] / [H+] [H+]2= K1* K2 [H+]2=K1 ?K2 —lg[H+]=pH;—lgK1=pK1; —lgK2=pK2 两边取负对数得2×—lg[H+]＝—lg K1＋—lgK2即:
pH=[ pK1 + pK2] / 2 = pI
第3页 共132页
生物化学课件完整版(极其详细)
分子的存在状态就是多种多样的,但在一定条件下以某一状态为主。
即aa的等电点pI就就是两性离子(R0)两侧的pK值的平均值。基团的pK值可查得,故pI值可由二pK值计算得之。
对于有三个解离基团的aa,如Asp、Lys只要取其兼(两)性离子两侧的pK值的平均值即得pI值。
COOH COO COO CH — NH+3 K1 CH — NH+3 K2 CH — NH+3 K3 Asp=
CH2 CH2 CH2
—
COOH COOH COO
——
Asp+(R+) Asp0(R0) Asp(R)
—
—
等电点时Asp主要以兼性离子R0存在,(R+)与(R—)很小且相等(等电状态为理想状态,pI为理论值)。
pI=(pK1+pK2)/ 2 同上
赖COOH COO COOCOO
CH—NH+3 K1 CH—NH+3 K2 CH—NH2 K3 CH—NH2
(CH2)4 (CH2)4 (CH2)4 (CH2)4
—
—
—
NH+3 NH+3 NH+3 NH2
—
(R2+) (R+) (R0) (R)
pI=(Pk2+pK3)/ 2 因R2+可忽略不计(pI时可认为它就是不存在的,否则就不就是等电状态了)。ε—NH2比α—NH2碱性强,结合H+能力大,结合后不易放出H+(因受COOH影响小)。 3、 氨基酸的化学性质:
⑴与强酸、强碱都可生成盐(铵盐与羧酸盐)如 谷氨酸钠
⑵与水合茚三酮的反应 80-100℃的条件下,首先使aa氧化脱羧脱氨形成醛,而本身被还原成还原型茚三酮,然后还原型茚三酮、氨与另一分子的水合茚三酮缩合形成蓝紫色的二酮茚—二酮茚胺,这就是α—aa 定性定量测定的基础,反应如下
O
H OH O O
N H O O O O O 第4页 共132页
O HO + NH3 +
HO O HO O N —3H2O
生物化学课件完整版(极其详细)
(二酮茚-二酮茚胺 紫兰色 吸收峰 570nm )Pro、羟—Pro生成黄色物质(因为无氨基) 用于比色、测定、层析、电泳的显色剂。因为产生CO2 ,也可用CO2气体分
析法测定aa(只限于α-氨基酸),肽与蛋白也有此反应,肽越大灵敏度越差。
⑶与亚硝酸的反应(aa的NH2基被氧化成 —OH),+NH3—N被氧化成N2,HNO2—N被还原为N2,等量进行。所以N2一半来自HNO2(其她伯氨基均可)。 生成N2的反应叫van slyke(范斯莱克)反应。
可测N2量(体积)计算氨基的含量。用于测定蛋白质的水解程度。
⑷ 与甲醛的反应:酸碱滴定没有适宜的指示剂(因为等当点过高或过低)。其氨基可与甲醛反应(加成),生成N—羟甲基或N,N—二羟甲基aa。使NH+3变为NH2释放出H+。使溶液酸性增强,可用NaOH滴定之。与NH2的含量相当,即aa含量。这就就是aa的甲醛滴定法,(滴定到放出的H+被中与时的 pH为终点)。
R－CH－COO R－CH－COO+H+ +NH3 NH2
+HCHO －
R－CH－COO NHCH2OH +HCHO －
R－CH－COO N(CH2OH)2
－
－
⑸与2,4—二硝基氟苯的反应(胺与卤代烷的反应)NH3的烷基化,生成黄色DNP—aa,不被酸水解。也可用之测肽与蛋白质的N—端aa,反应后酸解得N端的DNP—aa,有机溶剂提取分离,层析与标准氨基酸对比即可鉴定之。
H3C DNFB F 丹磺酰氯 CH 3 O2N N Sanger试剂 (5—二甲氨基萘磺酰氯)
NO2 R H R 2N—CH—COOH O O 2 N F + H 2 N —NCH—COOH
因为丹磺酰NOaa2有强烈的荧光,所以可用荧光光度计测定。(均在试剂与—NH2 NO2 O=S=O 之间脱去卤化氢)均称 Sangar反应。DNFB亦可与非α－氨基反应,如可生成:δ－DNP-鸟氨酸。 Cl ⑹与异硫氰酸苯酯(PITC)的反应,称艾德曼反应(Edman)反应:弱碱性条件下,
O N=C=S +aa
NH－C－NH－CH－COOH
N C S C CH NH R S R
形成苯氨基硫甲酰aa(PTC aa),在无水酸(硝基甲苯中与酸作用)环化为苯乙内酰硫脲氨基酸(简称PTH或PTH-氨基酸)。PTH在无水酸中极稳定。
PTC基的引入使紧接着的肽键减弱,所以在无水酸中只切下之(环化断裂同时发生)
第5页 共132页
生物化学课件完整版(极其详细)
