两种大肠杆菌表达融合蛋白的纯化
王飙落 陈南春 陈苏民
【关键词】融合蛋白 关键词:融合蛋白;纯化
0引言
利用原核生物来表达外源蛋白是一种简便高效的获取重组产物的方式.可是，重组蛋白在大肠杆菌中往往形成不溶解的无活性的包涵体，仅有少量产物以溶解状态存在.咱们通过两种不同的纯化方式，对如何取得有活性的蛋白表达产物进行初步的探讨.
1材料和方式
材料融合表达质粒pJLcIIras和pGEX-4T-mcp别离由陈苏民教授和王字玲博士惠赠.大肠杆菌菌株TAP106和JM109及GST亲和层析柱，Sepharose4B层析柱和其他生化制剂均由本校生化教研室提供.
方式将质粒pJLcIIras，pGEX-4T-mcp别离转化感受态TAP106，JM109，接种扩增后提取质粒行酶切鉴定.鉴定后菌种扩增至对数期，别离行37℃水浴和IPTG诱导表达，集菌并裂菌后120g・L-1SDS-PAGE别离鉴定菌体、裂菌后上清及沉淀中融合
蛋白p21ras和GST-MCP-1表达情形［1］.诱导扩增后的菌液离心搜集菌体，裂菌，TritonX100等去垢剂反复洗涤，最终离心后沉淀用8mol・L-1尿素溶液溶解.其中p21ras溶液别离针对4，2，1，，，，Sepharose4B凝胶柱平稳液进行缓慢梯度透析，终溶液经Sephrose4B柱层析后测定产物的GTP结合活性.GST-MCP-1那么针对GST亲和层析柱平稳液透析，离心后行GST亲和柱层析，产物经48孔微型趋扮装置测定其趋化活性［2］.
2结果
两种质粒经酶切鉴定符合构建条件.转化后的TAP106菌扩增及37℃诱导后，120g・L-1SDS-PAGE检测可见在约23ku处显现一条新生条带（图1）.紫外扫描测定约占菌体蛋白的%.转化后的JM109菌IPTG诱导后可见于30ku处显现一新生条带（图2）.紫外扫描测定约占菌体总蛋白的%.两新生条带别离符合融合蛋白p21cIIras和GST-MCP-1的分子大小.裂菌后的沉淀经TritonX100等溶液反复洗涤后，杂蛋白条带明显减少.产物p21cIIras经梯度透析后过柱纯化，具有明确的GTP结合活性.而GST-MCP-1溶液经平稳透析后那么直接行亲和层析，终产物有明确的单核细胞趋化活性. 图1略
图2略
3讨论
在原核生物尤其是大肠杆菌中表达外源基因产物时，所表达的真核生物蛋白的活性常难以维持.因原核生物的蛋白合成缺乏真核生物所具有的如糖基化等修饰进程，而且缺乏一些在肽链形成进程中必要的诱导分子，因此常常在胞质中形成难以溶解的无活性的包涵体［3，4］.
咱们实验中所见两种融合蛋白均要紧以包涵体形式存在，尽管为初步的纯化提供了有利条件，但却无法取得充沛的具有生物活性的重组蛋白产物.考虑到包涵体的形成要紧与肽链合成速度过快，没有足够的时刻和空间进行折叠和盘曲等空间构象的形成［5］，本实验采取了先用变性剂溶解包涵体，再通过缓慢的梯度透析慢慢除去变性剂，在这一进程中相当一部份肽链得以恢复其天然构象，成为可溶状态，经柱层析纯化后证明产物具有生物活性.本实验结果还说明，融合蛋白的表达方式可不能对其生物学活性产生严峻阻碍.设计合理的融合表达产物不但可使纯化进程简化，而且产物结构中酶切位点的存在也为进一步获取更高纯度和活性的重组蛋白制造了条件［6］.
参考文献:
［1］萨姆布鲁克，弗里奇，曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南［M］.北京:科学出版社，1992:20-35.
［2］陈苏民.大肠杆菌中高表达era重组蛋白的纯化及生化特性［J］.生物化学杂志，1992;1:33-41.
两种大肠杆菌表达融合蛋白的纯化
