博士资格考试试题
1．试述高通量基因型分析的含义及其在遗传研究中的作用。
高通量基因型分析就是使用基因芯片及新一代测序技术发掘序列多态性（主要是SNP标记），目前SNP主要以三种形式存在，转换、颠换、及插入缺失。
在遗传研究中的作用：（1）利用高通量基因型分析来迅速构建高密度的遗传连锁图谱，较常规的基于PCR的标记分析通量更高，更省时省力。在遗传图谱构建中高通量的基因分型方法可以更精准地检测出群体中的重组事件并确定重组断点，最终提高遗传图谱的分辨率，有利于更加精准的定位QTLs。（2）在基于自然群体的全基因组关联分析中，高通量的SNP技术更加能显示其通量高，省时省力的优势，也只有高通量的基因型分析产生的大批量分子标记才能适合全基因组关联分析。（3）更方便构建材料的DNA指纹图谱分析，用于品种的系谱来源研究及纯度分析 2.请您简述（1）农作物群体改良的原理 （2）自花授粉作物群体改良的方法 （3）如何利用现代生物技术手段提高群体改良的效率
农作物群体改良的原理：在一个完全随机交配的群体内，如果没有其他因素（如选择、突变等）干扰时，基因与基因型频率保存恒定，各世代不变，这是基因平衡定律。群体改良即不断的通过人为选择，打破群体基因和基因型的平衡，不断提高改良群体内人类所需基因及基因型的频率。选择和重组是群体进化的主要动力。
自花授粉作物群体改良的关键在于使其异交化，在合成基础群体时导入雄性不育基因，建立异交群体的方法是首先用杂交、回交法把隐形雄性核不育基因导入群体中的每个品系，然后再把回交获得的品系的种子等量混合在隔离区种植。由于只收获雄性不育株的种子，因此高水平的隐性雄性不育特性将继续保留在群体中。每一代选择优良的雄性不育株，以该改良群体作为第二轮改良的基础群体，重复这个过程。
现在生物技术可以采用分子标记辅助选择来提高群体改良的效率，前提是我们通过QTL定位等获取某些性状紧密连锁的分子标记，然后可以用分子标记对基础群体中的每一个株系进行选择，通过分子标记选择具有我们需要的优良等位基因的株系混合作为基础群体进行群体改良。其次在每一代的选择中我们都可以通过分子标记在苗期进行选择，选择具有优良等位基因的单株进行群体改良，缩小群体及减少工作量。最理想的状态是通过对所有性状的分子机制的理解，进行全基因组辅助的分子设计育种，做到定向、高效、精准育种。
3.如何利用生物技术和基因组学研究的成果克服传统育种方法的缺陷
传统育种存在的缺陷：（1）种间农艺性状的转移容易受到种间生殖隔离的限制；
（2）通过杂交进行转移优良基因的时候，容易受到连锁累赘的影响； （3）优良基因转移成功与否依赖于表型的鉴定，受到环境的影响大
转基因育种：转基因技术可针对目标性状精确改良，不仅省时而且可打破物种的界限，充分利用遗传资源
分子标记辅助选择育种：我们通过QTL定位等获取某些性状紧密连锁的分子标记，然后可以用分子标记对基础群体中的每一个株系进行选择，通过分子标记选择具有我们需要的优良等位基因的株系混合作为基础群体进行群体改良。其次在每一代的选择中我们都可以通过分子标记在苗期进行选择，选择具有优良等位基因的单株进行群体改良，缩小群体及减少工作量。最理想的状态是通过对所有性状的分子机制的理解，进行全基因组辅助的分子设计育种，做到定向、高效、精准育种。
分子设计育种：在分子标记辅助育种的基础上，随着近年来大量基因组序列数据、高通量基因型和植物表型鉴定技术的发展，众多重要性状功能基因的发掘，以及对分子标记与目标性状关系的深入了解进一步催生了设计育种的概念，即育种家可以根据需要，在电脑上进行模拟，从而设计出理想基因型的品种。分子设计育种在新基因挖掘、定向引入改良目标性状、创制新种质材料、改造亲本材料、缩短育种年限、提高选择准确度、提高杂种优势利用率等方面具有传统育种方法不可比拟的优越性。
4.关联分析的原理，常见问题及解决方法，在作物育种中的应用。
关联分析的原理：关联分析以连锁不平衡为基础鉴定某一群体内性状与遗传标记或候选基因间的关系。连锁不平衡是不同基因座位上等位基因的非随机组合。当位于某一座位的特定等位基因与同一条染色体另一座位的某一等位基因同时出现的几率大于群体中因随机分布而使两个等位基因同时出现的几率时，就称这两个座位处于LD状态。
关联分析的基本步骤：群体选择→估算群体结构→性状考察→多态性检测→统计分析 影响关联分析的因素
（1）标记数量，在全基因组扫描中,用标记对目标性状表型变异有贡献的所有座位进行扫描,需要大量分子标记。解决办法：1利用LD 程度高的群体进行全基因组关联分析, 可减少使用的标记数量。2连锁分析和关联分析相结合，根据连锁分析的结果，选择效应值比较大的QTL位点，利用更多的标记对自然群体进行LD 分析，对目标位点进行精细定位，然后根据已知基因组的信息选择适当的候选基因进行关联分析。
（2）群体结构，指的是一个群体内存在多个亚群。亚群的混合使整个群体的LD强度增强,可能导致不连锁的多态性基因位点与性状的关联,从而得出假阳性结果。解决办法：利用大量的不连锁、随机分别的SSR或RFLP标记对群体进行分析，再用统计方法消除群体结构和假阳性 （3）LD 衰减距离，LD 衰减距离越小，用更多的分子标记分析 关联分析的应用：
（1）关联分析进行功能基因的验证，对那些很难通过遗传转化验证基因功能的基因位点， （2）关联分析进行功能标记的开发，从而用于标记辅助选择。开发过程：在多个材料中对目 标性状进行调查，对目标基因进行序列分析，结合性状和基因序列信息进行基于连锁不平衡的关联分析，开发最优等位基因的功能标记
（3）关联分析进行数量性状的研究，全基因组关联分析可定位到更多的QTLs，候选基因关联分析可用于寻找最优的等位基因型 关联分析优点：（与连锁分析相比）
（1）花费的时间少,一般以现有的自然群体为材料，无需构建专门的作图群体。 （2）广度大，可以同时检测同一座位的多个等位基因。 （3）精度高，可达到单基因的水平
5.列举一种生物技术在抗病和抗逆育种中的应用。
转基因技术在植物抗病及抗逆育种中的应用非常有效且很广泛。以下主要以抗病和抗虫育种为例。转基因可以有效利用该物种中克隆得到的抗病和抗虫基因，也可以是该物种不存在的而在其他物种中存在的抗病基因。
我们通过图位克隆或者反向遗传学得到了某物种的抗病基因，可以直接将其通过转基因转移到主栽的感病品种中，特定的转移某一个基因，不存在回交育种过程中的连锁累赘，不改变该主栽品种的其他优良性状。比如目前利用做多的来自苏云金芽孢杆菌中的Bt蛋白，目前在棉花水稻抗虫育种中都得到了较好的利用，在我国转Bt基因抗虫棉成功的防治了棉铃虫等鳞翅目害虫，水稻中也得到了转Bt基因水稻，具有较好的抗虫性，在2009年获得安全证书。 6．简述一种基于转录本分析植物基因表达的技术及其原理和应用
目前较常用的为RNA-seq技术即转录组测序技术，就是把mRNA，smallRNA和NONcoding RNA用高通量测序技术把它们的序列测出来，以反映出它们的表达水平。
原理：提取总RNA，将所需的RNA纯化出来并进行片段化，随后反转录成cDNA，并在cDNA片段两端加上测序接头和引物，获得cDNA文库，用第二代测序技术进行高通量测序。如果有参考基因组，将测序后得到的reads直接与参考基因组比对，最终计算得每个基因的RPKM值；如果没有参考基因组，先组装转录组，然后再与组装的转录组比对得到每个转录子的RPKM值（RPKM即每百万reads中比对到平均1Kb的基因（转录子）上的read个数）此值的大小即为基因（转录子）的表达丰度。
应用：（1）转录本结构研究：可极大地丰富基因注释的很多方面，包括5′/3′边界鉴定、
UTRs区域鉴定以及新的转录区域鉴定，可变剪切的鉴定 （2）发现序列差异：如融合基因鉴定、编码序列多态性研究
（3）基因表达水平研究：相比传统的基因芯片技术，RNA-seq技术能更准确的确定
细胞中RNA的表达水平。
7简述一种基于蛋白质水平分析植物基因表达的方法技术原理及应用。
常用的方法有双向凝胶电泳联合质谱方法、鸟枪法LC-MS质谱鉴定、抗体芯片方法等。 双向凝胶电泳联合质谱的原理是：第一向根据蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS- PAGE分离，把复杂蛋白质混合物中的蛋白质在二维平面上分开。凝胶染色后可以利用图像分析系统成像，然后通过分析软件对蛋白质点进行定量分析，并且对感兴趣的蛋白质点进行定位。通过专门的蛋白质点切割系统，可以将蛋白质点所在的胶区域进行精确切割。接着对胶中蛋白质进行酶切消化，酶切后的消化物经脱盐/浓缩处理后就可以通过点样系统将蛋白质点样到特定的材料的表面（MALDI-TOF）。最后这些蛋白质就可以在质谱系统中进行分析，从而得到蛋白质的定性数据，通过与已有的数据库进行比对确定候选蛋白。
鸟枪法LC-MS质谱鉴定的基本原理是：蛋白质混合物经过简单或不经过SDS-PAGE分离就被酶切消化成肽段混合物，肽段混合物经过高效液相色谱分离形成较简单的组分，然后将其导入高分辨率质谱仪中进行质量分析。肽段在质谱仪中经离子化后，带上一定量的电荷，通过质量分析器的分析，可检测个肽段的质量与电荷的比值。通过与数据库匹配进行肽段鉴定，最后再从鉴定的肽段推导可能的蛋白。
抗体芯片方法：抗体芯片是蛋白芯片的一种，它的基因原理是首先制备目标蛋白的特异性的抗体，将不同的蛋白样品用荧光分子标记，再与抗体芯片杂交，杂交信号强弱反应了蛋白的表达水品高低。
这三种技术可用于分析作物的不同品种，或不同生理、病理条件下蛋白组的表达差异，有助于鉴定出影响作物品质、抗逆性、产量等性状的重要蛋白质。
8列举三种常用的第二代测序技术平台，简述其基本原理及其在作物遗传育种技术中的应用。
进入21世纪后，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。 （1）454技术原理
① 待测DNA文库的构建。把待测序列用喷雾法(nebulization)打断成300-800 bp的小片段并在小片段两端加上不同的接头，构建单链DNA(ssDNA)文库。②Emulsion PCR。将这些ssDNA与磁珠在一起孵育、退火，由于磁珠表面含有与接头互补的寡聚核苷酸序列，因此ssDNA会特异地连接到磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂，因此可以保证每一个与磁珠结合的小片段都会在各自的孵育体系内独立扩增，扩增产物仍可以结合到磁珠上。反应完成后，破坏孵育体系并富集带有DNA的磁珠。经过扩增反应，每一个小片段都将被扩增大约100万倍，从而达到下一步测序反应所需的模板量。③测序。预先用Bacillus stearothermophilus聚合酶和单链结合蛋白处理带有DNA的磁珠，然后将磁珠放置在PTP平板上，PTP板上含有很多直径约为44μm的小孔。测序反应采用焦磷酸测序法，将一种含有比PTP板上小孔直径更小的磁珠放入小孔，启动测序反应。测序反应以磁珠上大量扩增的ssDNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果这种dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化酶反应形成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化反应体系中的荧光素分子并发出荧光。测序反应产生的荧光信号由放置在PTP板另一侧的CCD照相机记录，再经过计算机分析转换为测序结果。由于每种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同，因此可以根据荧光的颜色来确定被测分子的序列。 （2）Illumina公司的Solexa技术
①待测DNA文库的构建把待测序列打断成200-500 bp的小片段，并在小片段两端加上不同的接头，建ssDNA文库。②这些ssDNA随机地附着在流动槽表面的channel上③向反应体系中
添加未标记的核苷酸和酶，进行Bridge PCR扩增反应。经扩增将桥型ssDNA扩增成桥型dsDNA。④将桥型dsDNA变性成ssDNA，继续扩增。经过不断的扩增变性循环，每一种ssDNA都在各自的位置达到能支持下一步测序反应所需信号强度的模板量。⑤测序方法采用边合成边测序的方法（SBS）。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP。由于这些dNTP的3′羟基被化学方法保护，因而每轮合成反应都只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱。加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，用光学设备完成荧光信号的记录，再通过计算机分析转化为测序结果。
（3）ABI公司的SOLiD技术
①待测DNA文库的构建 把待测序列打断成很小的片段，并在小片段两端加上不同的接 头，构建ssDNA文库。②Emulsion PCR。与454技术的Emulsion PCR类似，将带接头的ssDNA固定在磁珠表面，进行PCR扩增，并对扩增产物进行3’端修饰。③连接酶测序。体系中加入DNA连接酶、通用测序引物和具有3’-XXnnnzzz-5’结构的八聚核苷酸。在这个八聚核苷酸中，第1和第2位上的碱基是确定的，并根据种类的不同在第6-8位上加了不同的荧光标记。当八聚核苷酸由于第1和第2位配对而被连接酶连接上时，会发出荧光。在记录下荧光信息后，通过化学方法在第5和第6位之间进行切割，淬灭荧光信号，以进行下个位置的测序。通过这种方法，每次测序的位置都相差五位，即第一次测第1和第2位，第二次测第6和第7位……在测到末尾后，将新合成的链变性、洗脱。而后用通用测序引物进行第二轮测序。
第三代测序技术：基于边合成边测序的思想，将待测序列随机打断成小片段并在3'末端加上Poly(A)，用末端转移酶在接头末端加上Cy3荧光标记。用小片段与表面带有寡聚Poly(T)的平板杂交。然后，加入DNA聚合酶和Cy5荧光标记的dNTP进行DNA合成反应，每一轮反应加一种dNTP。将未参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱，检测上一步记录的杂交位置上是否有荧光信号，如果有则说明该位置上结合了所加入的这种dNTP。经过不断地重复合成、洗脱、成像、淬灭过程完成测序。
9传统育种学是通过提高一般配合力和特殊配合力来提高杂交种品种产量潜力，现代分子育种学是通过优良基因的聚合和累积优良基因的互作来提高杂交种产量潜力，你认为这两种观点是否矛盾？我们应该如何应用这些观点来指导杂交品种育种？
不矛盾。一般配合力指一个纯系（自交系）亲本与其他若干个品种（自交系）杂交后，杂种一代在某个数量性状上的平均表现。由基因的加性效应决定的。一个自交系所包含的有利基因位点越多，其一般配合力越高。特殊配合力是指两个特定亲本系所组配的杂交种的产量水平，又称为某一特定组合F1的实测值与其双亲一般配合力得到的预测值之差。特殊配合力只能在特定的组合中由双亲的等位基因间或者非等位基因间的互作而反应出来，是不能遗传的部分。
我们在杂交品种选育的过程中首先要选择配合力高的两个亲本，尤其是一般配合力要高（也就是说具有的优良基因多），这样容易得到强优势的杂种一代。另外尽可能选择性状良好并且能互补的两个材料，这样优良基因存在互补并更容易在杂种一代中累加。在选择一般配合力高的同时，我们也要尽可能选择特殊配合力高的材料，也就是充分利用双亲间优良基因的互作。
所以传统育种学中的一般配合力本质上也就是现代分子育种学中的优良基因的聚合，而特殊配合力本质上也就是优良基因之间的互作。 10 全基因组策略
2001年，全基因组选择的概念被提出，即估计全基因组上所有标记或单倍型的效应，从而得到基因组估计育种值。与传统的标记辅助选择的最大区别在于，全基因组选择不仅仅依赖于一组显著的分子标记，而是联合分析群体中的所有标记，以进行个体育种值的预测。与传统的分子标记辅助选择相比，全基因组选择有两大突破，一是基因组定位的双亲群体可以直接应用于育种；二是更适合于改良由效应较小的多基因控制的数量性状。
农作物复杂性状的分子育种需要操控许多因素，其中包括植物生长、发育和对各种生物和非生物逆境条件的反应。通过全基因组策略分子标记辅助育种的操作更加容易，并由此产生革命性
影响。全基因组策略的分子标记辅助育种利用全基因组测序和全基因组分子标记对代表性的或者全部遗传资源和育种材料进行分析，有效地考虑分子育种中面临的各种基因组和环境因素。大规模高密度的基因型鉴定和全基因组选择是该策略的两个重要组成部分。高通量和精确的表型鉴定和环境测试（e-typing）也是全基因组策略的重要组成部分。目前全基因组策略的基本策略包括（1）基于种子DNA的基因型鉴定，简化分子标记辅助选择，降低育种成本、增加规模和提高效率（2）选择性基因型鉴定和表型鉴定，结合DNA混合池分析，捕获和育种相关的大多数重要因素，（3）灵活的基因型鉴定系统（4）结合连锁作图和LD作图的方法进行标记-性状关联分析（5）基于序列进行分子标记开发、等位基因发掘、基因功能研究和分子育种。 11 CRISPR/Cas9
CRISPR-Cas最初被发现是因为它作为细菌的适应性免疫系统，利用RNA引导的核酸酶来剪切外来的基因元件。目前为止，在细菌和古生物中一共发现了三类CRISPR系统，它们都由Cas基因、非编码RNA和一个特殊的重复元件构成的CRISPR RNA（crRNA）阵列组成。
在利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时，Cas9可以被引导至不同目的基因的序列从而编辑不同的目的基因。此外，利用CRISPR/Cas9系统已经在不同的生物体和细胞系中成功进行了基因编辑，在这个过程中，为了保证基因编辑的最大成功率，通常要根据物种的不同，对Cas9要进行优化。CRISPR/Cas9系统通过特异性设计针对目的基因序列20个核苷酸大小的引物，可以将Cas9特异性地引导至目的基因序列，在操作时间上大大缩短。设计针对靶基因的引物大约就花费1-2周时间，而目的基因敲除的细胞系在2-3周内即可获得；CRISPR/Cas9系统也存在脱靶效应。目前为止，科研工作者对其主要缺点的解决办法是，通过生物信息学预测出多个容易脱靶的潜在位点，从而在sgRNA设计过程中避开这些潜在脱靶位点。 12请以抗虫棉的研制为例，阐述基因工程育种的一般过程。
（1）目的基因或DNA的获得。获得途径：①根据基因表达产物—蛋白质进行基因克隆②从基因组DNA或mRNA序列克隆基因；目前使用的棉花抗虫基因的来源包括苏云金芽孢杆菌的Bt基因和胰蛋白酶抑制基因。
（2）含有目的基因或DNA的重组质粒的构建。构建步骤：从原核生物中获取目的基因的载体并进行改造，利用限制内切酶将载体切开，并用连接酶把目的基因连接到载体上，获得DNA重组体。
（3）受体材料的选择和再生系统的建立。良好的植物基因转化受体系统应满足以下条件：高效稳定的再生能力；受体材料要有较高的遗传稳定性；具有稳定的外植株来源；对筛选剂敏感。 （4）转基因方法的确定和外源基因的转化：转化方法包括基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道法。
（5）转化体的筛选与鉴定。为了有效选择出这些真正的转化细胞，必须使用特异性的选择标记基因进行标记，转化体的鉴定根据检测水平的不同分为DNA、转录水平和翻译水平的鉴定。 13如何全面描述一个育种方法（如系谱、混合或轮回选择）的流程？
（1）系谱法，从杂种的第一次分离世代（单交F2，复交F1）开始，进行连续性的单株选择，直到选得性状优良而又整齐一致的系统，升入产量比较试验。 系谱法基本程序：a、杂种一代（F1）：以组合为小区种植，每小区30-50株。自花作物自由授粉，异花植物组合间隔离、组合内自由授粉，F1一般不做选择，按组合混收留种；b、杂种二代F2是剧烈分离的世代，也是注重选择的世代，入选的目标株应单株自交留种；c、杂种三代F3：按F2入选的单株后代（株系）为小区分别播种，每小区50株。10个小区设以CK，淘汰不良株系，优系中选优株自交，单株留种。系内高度一致者可升级鉴定。从F4以后均重复F3工作，优系中选优株自交直致系内纯合一致。e、品种比较试验 条件一致、三次重复、设置对照、保护行。入选最佳品系。f、区域试验 在与品比试验方法相似的基础上，按不同地区多点设置。一般由省或省级以上品种审定委员会安排，相应级别种子管理部门组织实施。
或：程序：亲本选配，配置组合；点播、组合编号，评定优良组合、淘汰不好组合，拔除假杂种、杂株、劣株，分组合混收，脱粒；按组合点播，确定优良组合，选优良单株，分株收获和脱粒，
华中农业大学作物遗传育种展业博士资格考试题库整理-2018
