improved nutritional value in rice grains
DNA去甲基酶OsROS1突变导致水稻籽粒糊粉层变厚及营养价值提高 发表时间：2018.10 发表期刊：PNAS（9.504）
可借鉴点：基因组、转录组、DNA甲基化修饰三个层面有效结合，完整揭示了性状产生的整体机制。 摘要：
水稻胚乳由外部单细胞糊粉层和内部淀粉质胚乳构成，是人类重要的主要食物。淀粉质胚乳主要储存淀粉，而糊粉层则富含蛋白质、维生素和矿物质。为了提高水稻的营养价值，研究者利用半种子实验（half-seed assay）筛选了糊粉层增厚的突变体，鉴定到厚糊粉层2-1（ta2-1）品系，其糊粉层平均有4.8 ± 2.2层细胞。ta2-1籽粒中除淀粉外的脂质、蛋白质、维生素、矿物质、膳食纤维等营养因子含量均有所增加。基于图谱的克隆显示TA2编码DNA去甲基酶OsROS1。OsROS1第14内含子的一处点突变导致可变剪切产生了一类额外的转录本mOsROS1，其中插入了来自内含子的21-nt。遗传学分析显示ta2-1表型的遗传具有不同于一般的配子体母体效应，并非由印记基因表达引起，而是由mOsROS1转录本的存在导致。TILLING鉴定到5个额外的ta2等位基因，它们可以增加糊粉细胞层数并且具有不同的遗传模式。WGBS显示ta2-1胚乳CG和CHG甲基化整体增加，同时两个公认与糊粉层分化相关的转录因子出现高甲基化和表达降低。此研究表明OsROS1介导的DNA去甲基化限制了水稻糊粉细胞层的数量，并提供了一种提高大米营养价值的方法。 背景：
谷物的三倍体胚乳由外部糊粉层和内部淀粉质胚乳组成，占到人类消耗主食的70%以上。胚乳发育从多核细胞的核分裂开始，之后会有胞质分裂和糊粉与淀粉胚乳的分化。尽管这两类组织有相同的发育起源，它们在形态、细胞命运和储存产物上存在区别。淀粉质胚乳在成熟时为死组织，主要积聚淀粉；糊粉层为活组织，储存蛋白质、脂质、维生素和矿物质。
多数谷物有单细胞层的糊粉，唯一的例外是大麦，具有2-3层细胞的糊粉层。在水稻中，糊粉层主要由单层细胞构成，但在背维管束附近有3或4细胞层构成小的加厚区域。一些参与糊粉层分化的基因已经在玉米和水稻中鉴定到。在玉米中，DEK1或CR4突变导致糊粉层局部缺失。水稻中DEK1同系基因ADL1突变或OsCR4表达抑制同样导致胚乳糊粉层局部
缺失。与此相对，NKD或SAL1突变会导致多糊粉细胞层胚乳的形成。水稻中RISBZ1和RPBF表达的抑制也会产生有多细胞层糊粉的胚乳。这些具有多细胞层糊粉的籽粒在灌浆过程中都存在严重缺陷，因此无法用于育种。
DNA甲基化在很多生物学过程中扮演必要角色。在植物中，DNA甲基化通常出现在CG、CHG和CHH序列的C残基中，并且受平衡的甲基化和去甲基化过程动态调控。以往研究已经鉴定出一些酶在拟南芥中激活DNA去甲基化。在雌性配子体和早期胚乳中性细胞表达的DME，是通过等位基因特异性去甲基化建立MEDEA印记表达的关键。DME的同源物（paralog）ROS组成性地进行表达，通过阻止DNA甲基化扩散和转座子的转录沉默来调控基因表达。在水稻中，ROS同系的OsROS1的敲除突变在雄性和雌性配子发生过程中都存在缺陷，因而不产生种子。
为了提高大米的营养价值，研究者利用正向遗传学方法筛选了具有加厚糊粉层的突变并鉴定到ta2-1突变株，其具有多种营养成分的增加。厚糊粉层（ta）表型通过一种不寻常的配子体母性效应遗传。分子遗传学分析表明，该表型由一种显性失活的mOsROS1转录本异常导致。 研究结果：
ta2-1突变表现出糊粉细胞层数量增加
研究者利用半种子实验筛选了6,000多株EMS诱变的M2水稻植株（ZH11）产生的约36,000个M3籽粒，得到了24个推定的ta株系。对应的M3胚被继续培养并得到M4籽粒，以对得到的ta2-1突变体进行详细鉴定。多种染色方法都确认ta2-1籽粒具有2-12层细胞构成的糊粉层，平均有4.8 ± 2.2层细胞。相较于半透明的野生籽粒，部分ta2-1籽粒是不透明的。这种差别在授粉后7天（DAP）时可见，在9 DAP更为明显。
研究者检查了五次回交后的农业性状，发现ta2-1没有出现可见的缺陷。不过，ta2-1的1000粒重和结实率分别减少了5.9%和8.2%，导致单株籽粒产量降低12.1%，每块样地产量降低18.0%。
ta2-1籽粒营养成分增加
研究者测量了ZH11和ta2-1去壳成熟籽粒中各种营养成分的含量，发现ta2-1的总蛋白量、脂质、铁、锌、钙、膳食纤维、抗氧化剂、酚类和多种维生素都有显著提升，而总淀粉和直链淀粉量略微下降。 ta2-1遗传学分析
遗传分析显示，带有ta2-1突变（TA2/ta2-1）杂合植株49.4%的籽粒呈现ta表型。当ZH11被ta2-1或TA2/ta2-1授粉，所有籽粒均为野生型表型；而ta2-1被ZH11或TA2/ta2-1授粉，所有籽粒呈现ta表型；TA2/ta2-1被ZH11或ta2-1授粉，大约50%籽粒呈现ta表型。这表明ta2-1性状的遗传具有配子体母体效应。 TA2的分子克隆
对ta2-1和籼稻（NJ6）后代基于图谱的克隆被用于鉴定TA2基因。根据>7,000个F2个体的结果，TA2被定位于一段包含3个基因的46 kb基因组区域（图1A）。序列分析显示，ta2-1在Os01g0218032的14号内含子处存在一处G-A突变（图1B）。此基因编码的蛋白与拟南芥ROS1具有最高水平的序列一致性，被认定为OsROS1。OsROS1包含拟南芥ROS1和DME中的全部3个保守结构域。
图1 TA2的分子特征
为了检验是否ta2-1的内含子突变改变了转录本，ZH11和ta2-1的胚乳OsROS1 cDNA被纯化并进行RT-PCR。除了ZH11中检测到的普通OsROS1转录本，在ta2-1中还找到另一条略大的转录本mOsROS1（图1C）。序列分析显示来自OsROS1 14号内含子的21个核苷酸序列出现在mOsROS1中，导致7个氨基酸残基（CSNVMRQ）的框内插入（图1D）。由ZH11扩增的包含OsROS1上游4.7 kb和下游11.4 kb的16.1 kb基因组序列被转化进入ta2-1。在三个独立株系中观察到ta表型的完全互补（图1E），表明ta2-1表型是OsROS1的
安诺基因文献解读-DNA去甲基酶OsROS1突变导致水稻籽粒糊粉层变厚及营养价值提高
