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用考马斯亮蓝测定动物药材中可溶性蛋
白质含量方法初探
（作者： ________ 单位： ____________ 邮编： ___________ ）
【摘要】目的探讨考马斯亮蓝法用于测定动物药材中可溶
性蛋白质含量的稳定性研究。方法 采用紫外分光光度法，以蟾蜍干体 为原料,牛血清白蛋白为对照，在595 nm处测定蛋白质与考马斯亮蓝 结合复合物的吸光值。结果 实验表明，吸光度和蛋白含量间具有良好 的线性关系（r=0.996）,样品在10 min内测定稳定（RSD=5.0%。结论 本方法可靠、简单、快速。
【关键词】 考马斯亮蓝；动物药材；可溶性蛋白质；含量测定 Abstract: Objective To study the stability of the Bradford
method for determ in ati on of soluble protein in an imal materials. Method The absorpti on of CBB G-250 comb ined with prote ins was determined
by the UV-Spectrophotometry method with the
detection wavelength at 595 nm, and the dried bufo was selected as sample, BSA as con trol. Results The method showed a good lin ear relati on ship betwee n absorpti on and prote in content (r=0.996). The sample was stable with in 10 min (RSD=5.0%).
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Con clusi on This method was reliable, simple and rapid. Key words : CBB Animal material ; soluble protein ; content measuri ng
考马斯亮蓝法是Bradford 1976年建立起来的测定蛋白质含量 的方法,这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。此方法的原理 是基于：考马斯亮蓝G-250是一种蛋白质染料，最大吸收峰在465 nm, 在酸性溶液中它与蛋白质通过范德瓦尔引力结合形成考马斯亮蓝 G-250-蛋白质复合物时，其最大吸收峰改变为 595 nm,吸光度与蛋白 质含量呈线性关系，故可用于蛋白质含量的测定。本实验室应用此方 法初步建立了动物药材可溶性蛋白质含量测定标准，从而进行了如下 相关实验的研究。
1材料与方法
1.1试剂与仪器
牛血清白蛋白（BSA）:北京鼎国生物技术有限责任公司。
Genview分装考马斯亮蓝G-250: Ultra pure上海生物工程有限公司； 盐酸：分析纯，北京世纪红星化工有限责任公司；无水乙醇：分析纯， 北京北化精细化学品有限责任公司；0.9%盐水,同领（大同）药业有限 公司；UV-2401 PC,SHIMADZUGL-88B漩涡混合器，江苏海门市其林 贝尔仪器制造有限公司
1.2溶液的配制
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考马斯亮蓝G-250溶液配制：称取20 mg考马斯亮蓝G-250 溶
于20 mL 95%的乙醇中，另取36%&酸3 mL和113 mL盐水混匀，再 与考马斯亮蓝乙醇液混合并定容至 200 mL,用前0.45卩m过滤。1 mg/mL BSA溶液配制：称取10 mg BSA冻干粉溶于蒸馏水中并定容至 10 mL。
1.3 BSA与考马斯亮蓝G-250结合后溶液光吸收值的稳定性 分别取 100 卩 L BSA含量为 314.75 卩 g/mL、630 ng/mL、2.5 ng/mL 标准溶液，各加入3 mL考马斯亮蓝溶液，于595 nm分别在5、10、20 min测定。
1.4 BSA线性关系考察
取 BSA标准 630、315、157、79、40、20、10、5、2.5
ng/mL 各100卩L加入3 mL考马斯亮蓝G-250溶液中，涡旋混匀，分别于5、 30 min在595 nm处测定。
1.5动物药材水提液可溶性蛋白质线性关系考察 1.5.1动物药材可溶性蛋白质提取液的制备
将蟾蜍干药材粉碎，过80目筛,取40 g用80 mL蒸馏水润湿并搅 匀，于4 C冰箱静置48 h,4 C、9 000 r/min离心40 min,取上清,0.45 a m过滤即得原液。
1.5.2动物药材水提液可溶性蛋白质线性关系
将原液用蒸馏水10倍稀释,并将稀释液依次10倍稀释,各取100 卩L加入3 mLCBB夜中，涡旋混匀，595 nm测定，得到样品最低定量
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限， 并初步确定待测的浓度范围。将所需的浓度样品做倍比稀释 ，最高浓
度标记为64,依次稀释为32、16、8 4、2、1,各取100卩L加入3 mL CBB液中，涡旋混匀,595 nm测定。
2结果
2.1 BSA与考马斯亮蓝G-250结合后溶液吸光值稳定性测定结果 （见表1）表1 BSA与考马斯亮蓝G-250结合后溶液吸光值稳定性 研究（略）注：表中每个光密度值是 3次试验的平均值。
由表1可看出：溶液光密度值随着时间变化而变化，浓度较高时呈负 吸收,复合物吸光值在10 min内RSD较小,溶液较稳定，浓度太高或太 低稳定性都较差，所以寻找适当的蛋白质浓度，并且在10 min内测定 很重要。
2.2 BSA浓度对吸光度的线性关系
5 min时在400?800 nm对标准蛋白复合物全波长扫描，当浓度为5.0 ng/mL的S/N=3,5.0 ng/mL可作为最低检测限，实验表明：40 ng/mL 作为最低定量限，由图1可看出5?40卩g/mL不呈线性，在40?630 ng/mL线性较好，说明蛋白质浓度较低时有线性关系，但浓度太低时不 存在线性。
5 min时测得的R=0.996,在30 min时测定标准蛋白复合物线性 关系时R=0.941,由相对标准偏差可知，复合物随着时间变化线性关系 变差
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（见图2、图3）。
2.3动物药材粗提液可溶性蛋白质的线性关系
试验过程中在原液108稀释时得到复合物最低检测限，将
106倍稀释液作为基础倍比稀释，在10 min内测定线性关系
较好（见图4）。
3讨论
虽然Bradford法有不少优点，但由于受到影响的因素较多
优化出一套较好的实验条件并不容易。 Marcelo等［1］对此法的机制 进行了深入的研究，认为pH值、时间、温度是本方法的重要变量。由 于温度的影响具体操作有困难，本实验未对温度进行研究。对时间的 考察本实验认为在复合物形成后的10 min内测定比较好。
实验中所用标准蛋白与样品均用蒸馏水溶解 ，已有研究证明
不同溶剂光吸收的差异对蛋白质的测定结果无影响 ［2］。而且本实验 蛋白溶液和考马斯亮蓝溶液体积比为 1 : 30,溶剂对光吸收的影响更 小。
H+浓度是影响标准曲线线性关系的主要因素，适当控制显色
液中的H+浓度使显色前后H+浓度保持恒定非常重要。有文献用磷酸 配缓冲液，但酸浓度不好控制，酸浓度降低灵敏度增大，但酸浓度低到
用考马斯亮蓝测定动物药材中可溶性蛋白质含量方法初探
