PEDF对人肺腺癌A549细胞增殖与凋亡的影响
娄志霞1，束 军1，金 程1，沈继龙2
【摘 要】摘要：目的探讨不同浓度色素上皮衍生因子（PEDF）作用不同时间对体外培养的人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响。方法用不同浓度（0、80、160、320、640 nmol／L）的重组人PEDF蛋白对体外培养的人肺腺癌细胞株A549进行干预，在处理24、48、72 h后，分别用MTT法检测PEDF对A549细胞增殖的抑制率并比较；在作用48 h后，以流式细胞仪检测技术计算、分析A549细胞凋亡率。结果不同浓度PEDF（0、80、160、320、640 nmol／L）干预A549细胞相同作用时间（24、48、72 h）情况下，随着PEDF浓度的增加，PEDF对A549细胞的增殖抑制率递增（P＜0.05）；相同PEDF浓度（80、160、320、640 nmol／L）情况下，除了80、160 nmol／L PEDF作用24 h和48 h的细胞增殖抑制率间差异无统计学意义外，随着PEDF作用时间的延长，PEDF对A549细胞的增殖抑制率也基本呈递增趋势（P＜0.05）。上述不同浓度的PEDF处理A549细胞48 h，细胞凋亡率随着PEDF浓度的升高呈递增趋势（P＜0.05）。结论PEDF在体外能抑制人肺腺癌细胞株A549的增殖并诱导其凋亡。PEDF抑制细胞增殖作用可能和PEDF浓度及作用时间有关，PEDF诱导细胞凋亡作用的强弱也与PEDF浓度有一定关系。
【期刊名称】安徽医科大学学报 【年(卷),期】2014(000)010 【总页数】4
【关键词】色素上皮衍生因子；肺腺癌；A549；细胞增殖；细胞凋亡
色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）是Tombram-Tink et al［1］首次在视网膜上皮细胞培养液中发现的一种分泌型糖蛋白，具有抗新生血管形成等多种生物活性。有报道［2］称PEDF抑制血管增生的效果比血管他定强2倍，比内皮他定强7倍。迄今为止肺癌仍然占癌症相关死亡的绝大部分比例［3］，患者的5年生存率不足15%［4］。通过抑制新生血管的形成来控制肿瘤的发展是一个已被证实的有效的抗肿瘤治疗方法［5］。Chen et al［6］研究发现PEDF蛋白能显著抑制肺癌细胞的生长、增殖。本课题组前期研究［7］亦提示，PEDF可以显著抑制NCI-H460细胞的增殖并能促进细胞凋亡。然而，针对不同时间点观察不同浓度PEDF对肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响，尚未见文献报道。该研究拟探讨不同浓度PEDF作用不同时间，对于体外培养的人肺腺癌细胞系A549细胞增殖和凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器PEDF蛋白购自以色列ProSpec公司；胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司；RPMI-1640培养基购自美国HyClone公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）和二甲基亚砜（DMSO）均购自美国Sigma公司。CO2细胞培养箱购自德国Heraeus公司；ELX800UV酶标仪购自美国Bio-Tek公司；流式细胞仪购自美国BD公司；超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司；电热恒温水浴锅购自上海天平仪器厂。
1.2 细胞培养人肺腺癌细胞株A549由安徽医科大学附属省立医院检验科实验室惠赠。用含100 ml／L胎牛血清和2 mmol／L谷氨酰胺的RPMI-1640培养液，于37℃、5%CO2培养箱内传代常规培养。
1.3 MTT法检测PEDF对肺腺癌A549细胞生长增殖的作用待细胞处于对数生
长期时，0.25%胰酶消化后1 000 r／min离心5 min，用培养液制成细胞悬液。以5×104个／ml的密度接种到96孔培养板，每孔加100 μl细胞悬液、边缘孔加无菌PBS，置37℃、5%CO2培养箱培养过夜。实验分为空白对照组和不同浓度PEDF干预组，每组设置4个复孔。细胞贴壁后分别加入不含PEDF的完全培养基及不同浓度的PEDF蛋白20 μl，使PEDF终浓度分别为0、80、160、320、640 nmol／L。加入PEDF后，分别在干预24、48、72 h时每孔加入10 μl MTT液继续培养4 h，形成结晶后吸去培养液，每孔加150 μl DMSO，摇床振荡10 min后置酶标仪波长570 nm处测吸光度值（A570）。抑制率（%）＝（1－PEDF干预组A570值／空白对照组A570值）×100%。实验重复3次。
1.4 流式细胞仪检测PEDF对A549细胞凋亡的影响细胞处于对数生长期时，0.25%胰酶消化后、以每瓶2×104个／ml的密度接种于细胞瓶中。实验分为空白对照组和不同浓度PEDF干预组。细胞贴壁生长后，弃上清液，分别加入不含PEDF的完全培养基和PEDF蛋白20 μl，使PEDF终浓度分别为0、80、160、320、640 nmol／L。继续在细胞培养箱中孵育48 h后，用0.25%胰酶消化、收集所有细胞，70%乙醇于4℃固定30 min，PBS冲洗残留乙醇两次，加入150 μl Rnase（5 g／L）和150 μl PI溶液（50 μg／ml），于室温避光染色30 min后，进行流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率。
1.5 统计学处理采用SPSS 17.0软件进行分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，数据两两比较采用SNK检验。
2 结果
2.1 PEDF抑制人肺腺癌A549细胞的增殖MTT法检测结果显示：终浓度为0、
PEDF对人肺腺癌A549细胞增殖与凋亡的影响
