实验五人类染色体标本制备
【目的要求】
1 ?熟悉人外周血淋巴细胞培养的原理。
2. 初步掌握人类外周血淋巴细胞染色体标本的制备方法。 3?了解正常人非显带染色体核型特征及核型分析方法。
【实验原理】
人类间期细胞核中的遗传物质染色质，在细胞进入分裂期时，经逐级螺旋形成染色体。
在分裂期的中期，染色体达到最大程度的凝集， 表现为短而粗的典型结构。 人外周血的有形 成分中，只有白细胞有核，而白细胞中只有淋巴细胞（主要是小淋巴细胞）具有潜在的细胞分 裂能力。
培养液中加入有丝分裂刺激剂植物血凝素 巴细胞转化为具有分裂能力的淋巴母细胞，
（PHA）可使处于G期、具有潜在分裂能力的淋
并进入旺盛的有丝分裂周期； 加入纺锤体抑制剂
秋水仙素可使处于分裂过程的淋巴细胞停滞在分裂中期，在收获细胞时，用低渗剂 0.075
mol/L KCI对细胞进行低渗处理，可使胞膜胀破，染色体均匀分散；经离心、固定、制片等 过程，最终可
获得便于观察分析的染色体标本。
制备的染色体标本片，不经特殊处理，直接染色， 析的过程称为染色体非显带核型分析。
【实验用品】
在显微镜下观察识别，并进行核型分
（一） 材料：人外周静脉血。
（二） 器材：吸管、刻度离心管、量筒、 5ml注射器、6号针头、台式离心机、试管架、 冷藏载玻
片（一端磨砂）、铅笔、酒精灯、超净工作台、恒温水浴箱、载玻片、止血带、酒 精棉球、显微镜、废液缸。
（三） 试剂
1. RPMI1640 培养液
（1） RPMI1640 : RPMI1640固体培养基10.4 g,溶于1000 ml双蒸水中，抽滤除菌。 （2） RPMI1640培养液：每100 ml RPMI1640培养液中含 RPMI 1640 80 ml、灭活的小牛血 清20 ml、PHA 50 mg 青霉素（终浓度100 U/ml）、链霉素10000卩g （终浓度100卩g /ml）, 15磅、20min高压灭菌的NaHCO调pH至7.2?7.4，分装20小瓶，每瓶5 ml。
（3） 配制方法
配制过程所需的玻璃器具先用浅水洗刷干净，烘干，放入清洁液中浸泡
2d，取出后用自来
水冲洗15次，蒸馏水冲洗 3次，双蒸水冲洗1次，烤干后包装，15磅20 min高压灭菌。
新瓶塞等橡胶类制品用水洗刷后，
用0.5mol/L NaOH煮沸20min，自来水冲洗；用0.5mol/L
HCl煮沸20 min，自来水冲洗，蒸馏水冲洗，在双蒸水中浸泡 24h ;浸泡后取出晾干，包装后高 压
灭菌。使用过的橡胶制品用肥皂液洗后，再用自来水，蒸馏水、双蒸水冲洗，晾干包装后高 压灭菌。
无菌室用紫外灯消毒 2 h。进入无菌室前用肥皂彻底洗手，双手在新洁而灭溶液中浸泡 20
min，然后穿隔离衣，戴口罩、帽子，进入无菌室操作时，再用 75%酒精擦手。
在无菌室内，将 RPMII640粉剂10.4 g,溶于1000 ml双蒸水中，(RPMI1640粉剂较难溶， 可用酒精灯微火稍加热，或通入CQ使pH降至6.0左右可溶解)。液体呈透明状说明已完全溶解， 倒入细菌滤器中过滤除菌。
在无菌室的超净工作台内，取适量已抽滤的 青霉素和链霉素，混匀，用经过
RPMI1640加入成比例的灭活小牛血清、 PHA
15磅20 min高压灭菌的5% NaHCO调至pH7.2，分装成每瓶5
RPMI1640也需冷冻保存。
ml,冰冻保存。已除菌过滤、未分装的
2 .无菌肝素(500 U/ml ):肝素注射液1支2 ml (含12500 U),加23 ml无菌生理盐水 混匀(或肝
素粉剂，用时配成
0.2%肝素液)，经8磅15 min高压灭菌，置4C冰箱保存备用。
3. 其他试剂：0.01%秋水仙素、0.075 mol/L KCl 低渗液、Carnoy固定液、10% Giemsa 染液。
【实验操作】
(一)染色体标本制备 1.取材培养
(1) 采血：用无菌注射器吸取约 0.2 ml肝素液，来回抽动针筒，使肝素湿润针筒，戴上 针头套；
彻底消毒采血处皮肤，抽取静脉血约 2 ml，戴上针头套，转动针筒，使肝素与血液 混匀，防止血液凝固(采血过程中严格执行无菌操作)。
在超净工作台内，去掉针头套，用无菌棉球擦除针头上的血迹；用酒精棉球消毒盛有5 ml 培养液的培养瓶瓶塞，
并将瓶塞在酒精灯火焰上过一下；
在酒精灯火焰旁，将采血的注射器
针头经培养瓶皮塞插入培养瓶中，每瓶接种血液约 0.3 ml ,轻轻摇匀。
(2) 培养：培养瓶置37C恒温箱中培养，当培养至68 h,取出培养瓶，在超净工作台内， 用注射器(5号针头)向培养瓶中加入0.01%秋水仙素1滴，轻轻摇匀，放回37 C恒温箱继续培 养至72 h。
2?气干法制片
(1) 收集细胞：将培养瓶中的培养物用吸管移入刻度离心管内，离心 r/min )，弃上清液，为防沉淀物中细胞丢失，可适当留点上清液。
(2) 低渗：向离心管中加6m1预温37C的0.075 mol/L KCl低渗液，用吸管向离心管底部
充气，轻轻将细胞沉淀冲散打匀，离心管放入
8?10 min (1000
37 C水浴箱中低渗处理15 min。
(3) 预固定：低渗处理后，加 Carnoy固定液约0.5?1 ml，用吸管轻轻冲打混匀，预固 定；然后
离心8?10 min(1000 r/min)，弃上清液。预固定可防止细胞在固定时集聚成块。
(4) 固定：在沉淀物中加 Carnoy固定液5 m1,用吸管将沉淀物轻轻冲打均匀，室温下静
置固定20 min,离心8?10 min(1000r/min),弃上清液。固定有利于染色体在载玻片上展开,
保持染色体结构完整；如固定不充分，则染色体形象模糊，染色体周围有胞浆背景。为提高 制片质量，此步操作可重复一次。
(5) 制备细胞悬液、制片： 弃上清，留下 0.5ml 左右的固定液，打匀，用滴管滴在干净
的载玻片上，空气干燥， Giemsa染色5?15min。空气干燥已染好色的标本后可镜下观察。
实验五人类染色体标本制备
