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实验五人类染色体标本制备

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实验五人类染色体标本制备

【目的要求】

1 ?熟悉人外周血淋巴细胞培养的原理。

2. 初步掌握人类外周血淋巴细胞染色体标本的制备方法。 3?了解正常人非显带染色体核型特征及核型分析方法。

【实验原理】

人类间期细胞核中的遗传物质染色质,在细胞进入分裂期时,经逐级螺旋形成染色体。

在分裂期的中期,染色体达到最大程度的凝集, 表现为短而粗的典型结构。 人外周血的有形 成分中,只有白细胞有核,而白细胞中只有淋巴细胞(主要是小淋巴细胞)具有潜在的细胞分 裂能力。

培养液中加入有丝分裂刺激剂植物血凝素 巴细胞转化为具有分裂能力的淋巴母细胞,

(PHA)可使处于G期、具有潜在分裂能力的淋

并进入旺盛的有丝分裂周期; 加入纺锤体抑制剂

秋水仙素可使处于分裂过程的淋巴细胞停滞在分裂中期,在收获细胞时,用低渗剂 0.075

mol/L KCI对细胞进行低渗处理,可使胞膜胀破,染色体均匀分散;经离心、固定、制片等 过程,最终可

获得便于观察分析的染色体标本。

制备的染色体标本片,不经特殊处理,直接染色, 析的过程称为染色体非显带核型分析。

【实验用品】

在显微镜下观察识别,并进行核型分

(一) 材料:人外周静脉血。

(二) 器材:吸管、刻度离心管、量筒、 5ml注射器、6号针头、台式离心机、试管架、 冷藏载玻

片(一端磨砂)、铅笔、酒精灯、超净工作台、恒温水浴箱、载玻片、止血带、酒 精棉球、显微镜、废液缸。

(三) 试剂

1. RPMI1640 培养液

(1) RPMI1640 : RPMI1640固体培养基10.4 g,溶于1000 ml双蒸水中,抽滤除菌。 (2) RPMI1640培养液:每100 ml RPMI1640培养液中含 RPMI 1640 80 ml、灭活的小牛血 清20 ml、PHA 50 mg 青霉素(终浓度100 U/ml)、链霉素10000卩g (终浓度100卩g /ml), 15磅、20min高压灭菌的NaHCO调pH至7.2?7.4,分装20小瓶,每瓶5 ml。

(3) 配制方法

配制过程所需的玻璃器具先用浅水洗刷干净,烘干,放入清洁液中浸泡

2d,取出后用自来

水冲洗15次,蒸馏水冲洗 3次,双蒸水冲洗1次,烤干后包装,15磅20 min高压灭菌。

新瓶塞等橡胶类制品用水洗刷后,

用0.5mol/L NaOH煮沸20min,自来水冲洗;用0.5mol/L

HCl煮沸20 min,自来水冲洗,蒸馏水冲洗,在双蒸水中浸泡 24h ;浸泡后取出晾干,包装后高 压

灭菌。使用过的橡胶制品用肥皂液洗后,再用自来水,蒸馏水、双蒸水冲洗,晾干包装后高 压灭菌。

无菌室用紫外灯消毒 2 h。进入无菌室前用肥皂彻底洗手,双手在新洁而灭溶液中浸泡 20

min,然后穿隔离衣,戴口罩、帽子,进入无菌室操作时,再用 75%酒精擦手。

在无菌室内,将 RPMII640粉剂10.4 g,溶于1000 ml双蒸水中,(RPMI1640粉剂较难溶, 可用酒精灯微火稍加热,或通入CQ使pH降至6.0左右可溶解)。液体呈透明状说明已完全溶解, 倒入细菌滤器中过滤除菌。

在无菌室的超净工作台内,取适量已抽滤的 青霉素和链霉素,混匀,用经过

RPMI1640加入成比例的灭活小牛血清、 PHA

15磅20 min高压灭菌的5% NaHCO调至pH7.2,分装成每瓶5

RPMI1640也需冷冻保存。

ml,冰冻保存。已除菌过滤、未分装的

2 .无菌肝素(500 U/ml ):肝素注射液1支2 ml (含12500 U),加23 ml无菌生理盐水 混匀(或肝

素粉剂,用时配成

0.2%肝素液),经8磅15 min高压灭菌,置4C冰箱保存备用。

3. 其他试剂:0.01%秋水仙素、0.075 mol/L KCl 低渗液、Carnoy固定液、10% Giemsa 染液。

【实验操作】

(一)染色体标本制备 1.取材培养

(1) 采血:用无菌注射器吸取约 0.2 ml肝素液,来回抽动针筒,使肝素湿润针筒,戴上 针头套;

彻底消毒采血处皮肤,抽取静脉血约 2 ml,戴上针头套,转动针筒,使肝素与血液 混匀,防止血液凝固(采血过程中严格执行无菌操作)。

在超净工作台内,去掉针头套,用无菌棉球擦除针头上的血迹;用酒精棉球消毒盛有5 ml 培养液的培养瓶瓶塞,

并将瓶塞在酒精灯火焰上过一下;

在酒精灯火焰旁,将采血的注射器

针头经培养瓶皮塞插入培养瓶中,每瓶接种血液约 0.3 ml ,轻轻摇匀。

(2) 培养:培养瓶置37C恒温箱中培养,当培养至68 h,取出培养瓶,在超净工作台内, 用注射器(5号针头)向培养瓶中加入0.01%秋水仙素1滴,轻轻摇匀,放回37 C恒温箱继续培 养至72 h。

2?气干法制片

(1) 收集细胞:将培养瓶中的培养物用吸管移入刻度离心管内,离心 r/min ),弃上清液,为防沉淀物中细胞丢失,可适当留点上清液。

(2) 低渗:向离心管中加6m1预温37C的0.075 mol/L KCl低渗液,用吸管向离心管底部

充气,轻轻将细胞沉淀冲散打匀,离心管放入

8?10 min (1000

37 C水浴箱中低渗处理15 min。

(3) 预固定:低渗处理后,加 Carnoy固定液约0.5?1 ml,用吸管轻轻冲打混匀,预固 定;然后

离心8?10 min(1000 r/min),弃上清液。预固定可防止细胞在固定时集聚成块。

(4) 固定:在沉淀物中加 Carnoy固定液5 m1,用吸管将沉淀物轻轻冲打均匀,室温下静

置固定20 min,离心8?10 min(1000r/min),弃上清液。固定有利于染色体在载玻片上展开,

保持染色体结构完整;如固定不充分,则染色体形象模糊,染色体周围有胞浆背景。为提高 制片质量,此步操作可重复一次。

(5) 制备细胞悬液、制片: 弃上清,留下 0.5ml 左右的固定液,打匀,用滴管滴在干净

的载玻片上,空气干燥, Giemsa染色5?15min。空气干燥已染好色的标本后可镜下观察。

实验五人类染色体标本制备

实验五人类染色体标本制备【目的要求】1?熟悉人外周血淋巴细胞培养的原理。2.初步掌握人类外周血淋巴细胞染色体标本的制备方法。3?了解正常人非显带染色体核型特征及核型分析方法。【实验原理】人类间期细胞核中的遗传物质染色质,在细胞进入分裂期时,经逐级螺旋形成染色体。在分裂期的中期
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