细菌性疫苗制造技术
任务一 灭活苗制造流程
菌种选取（强毒株) → 菌液培养 → 灭活 ↓ ↓
配苗（5份菌液+1份铝胶配苗) ← 浓缩 工序一 菌种与种子培养
选用毒力强、免疫原性好1～3个品系菌株，按规定定期复壮和鉴定，将合格菌种增殖培养并经无菌检查、活菌计数达到原则后作为种子液。种子液保存于2～8℃冷暗处，在有效期内用于菌苗生产种子使用。大肠杆菌病菌种应采集动物心血、腹水、肝渗出物、气囊附着物或正常动物肠道内容物作为接种物。如用含大肠杆菌病料，一方面对大肠杆菌进行分离、鉴定，符合规定方可作为菌种使用。
工序二 菌液培养
用于规模化细菌培养办法诸多，有手工式、机械化或自动化等方式。可供菌体培养办法有：固体表面培养法、液体静置培养法、液体深层通气培养法和透析培养法。普通固体培养易获得高浓度细菌悬液，含培养基成分少，易稀释成不同浓度，但生产量较小。因而，大量生产疫苗时惯用液体培养法。
实例 大肠杆菌菌液培养办法
(1)．将生化成果典型菌种接种于伊红美兰琼脂平板或麦康凯琼脂平板上，置37℃温箱中培养18～24h，挑取单个典型菌落接种于琼脂斜面，置37℃温箱中培养18～24h，经显微镜检查无杂菌污染者，即可作为种子培养物。 (2)．取5ml马丁肉汤加入琼脂斜面洗下菌苔作为一级种子，用灭菌吸管按5%量将一级种子接种于马丁肉汤中，置37℃培养18～24h后作为二级种子。 (3)．二级种子可以接种到营养琼脂培养基或马丁肉汤中做进一步扩大培养。如接种到营养琼脂培养基表面，37℃培养24～48h后，加入灭菌生理盐水，用灭菌接种环或特制刮子将菌苔刮下，倾入灭菌离心管中，低速离心5min (500r/min)，使其中也许掺杂琼脂块下沉。吸取上层细菌悬浮液加入盛有玻璃珠灭菌瓶中，用手或振荡器振荡30min，使细菌均匀分散,取少量菌液装于灭菌试管中供计数用，别的细菌将灭活(强毒细菌须在杀菌后，再行计数)。
如接种于马丁肉汤培养基，经37℃培养24～48h后，直接取少量菌液供计
数用，别的细菌则灭活。
工序三 菌数计算
采用活菌计数法或比浊计数法，以概略地计算出每毫升菌液中细菌总数。 工序四 灭活与浓缩
对大肠杆菌菌液应加入0.5％甲醛溶液，置37℃温箱作用48～72h，以达到杀死细菌目。灭活后需对菌液进行浓缩，惯用浓缩办法有离心沉降法、氢氧化铝吸附沉淀法和羧甲基纤维沉淀法。可使菌液浓缩1倍以上。
工序五 配苗与分装
配苗就是在菌苗制备过程中加入佐剂，以增强免疫效果。由于灭活菌苗所用佐剂不同，因此配苗办法也不同。例如,大肠杆菌氢氧化铝菌苗细菌计数所得原菌液浓度，用灭菌生理盐水将其稀释成最后浓度为100亿～400亿个/ml。按每5份菌液加入1份氢氧化铝胶配苗，同步加入0.01%硫柳汞，充分振荡，置2～8℃静止2～3d，抽弃上清液，浓缩成全量60%。塞上胶塞，用固体石蜡溶化封口，贴上标签，注明菌苗名称。使用前充分摇匀。,整个制备过程都必要在无菌条件下按照无菌操作进行
简介惯用灭活剂 1.甲醛
甲醛是最古典、也是应用最广一种灭活剂。为无色气体，易溶于水和乙醇，其36％～40％水溶液称为福尔马林。
甲醛用于疫苗灭活浓度为0.1％～0.5％。普通需氧细菌用0.1％～0.2％浓度，厌氧菌则多用0.4％～0.5％浓度。病毒可在0.05％～0.4％之间，多数使用0.1％～0.3％。
2.苯酚 又称石炭酸。为无色结晶或白色熔块，有特殊气味，有毒及腐蚀性，易潮解，溶于水及有机溶剂。置于空气中易被氧化，应避光保存。 灭活机制是使微生物蛋白质发生变性和抑制特异酶系统（如脱氨酶、氧化酶等）活性，从而导致微生物死亡。制作生物制品惯用浓度为0.3％～0.5％。 3.β-丙内酯 又名为羟基丙酸-β-内酯，性状为不稳定，无色，有刺激气味液体，是一种良好病毒灭活剂。
β-丙内酯灭活机制是破坏病毒核芯，但不损害衣壳蛋白，因而能保持病毒良好免疫原性，重要用于狂犬病灭活苗制备。
4.结晶紫 是一种带有金属光泽绿色结晶或深绿色结晶状粉末碱性染料，易
溶于醇、氯仿，不溶于水和醚。
灭活机制重要是它阳离子与微生物蛋白质羧基形成带弱电化合 物，妨碍了微生物正常代谢，扰乱微生物氧化还原作用，使电势太高而不适于微生物增殖，对革兰氏阳性菌重要是干扰细胞壁肽聚糖合成。
5.硫柳汞 又称乙基汞硫代水杨酸钠，为无色结晶或乳白色粉末，微有特殊气味，易溶于水和乙醇，不溶于乙醚和苯，应避光保存。用于生物制品防腐和消毒，对霉菌、细菌和病毒均有一定灭活作用。惯用浓度为0.01％～0.02％。 6.烷化剂 是具有烷基分子中去掉一种氢原子与另一种化合物作用，将烷基引入，形成烷基取代物。其灭活机制是烷化微生物DNA、RNA分子中鸟嘌呤或腺嘌呤，引起单链断裂、双链交联，也可与酶系统和核蛋白起作用，破坏核酸代谢、合成，使病毒丧失感染力，但不损害蛋白衣壳，从而保存其抗原性。此类烷化剂惯用有N-乙酰乙烯亚胺、二乙烯亚胺及缩水甘油醛等。
简介惯用免疫佐剂 (一)免疫佐剂概念
免疫佐剂又称佐剂，是指单独使用没有免疫原性，与抗原物质合并使用能非特异性地变化或增强机体对该抗原特异性免疫应答，发挥其辅佐作用一类物质。其作用特点是：①对某些分子相对质量小多糖或多肽等抗原性薄弱物质，可明显增强其抗原性；②可用最小抗原量、至少接种次数，刺激机体产生足够免疫应答和高滴度抗体，在血流中或黏膜表面维持较长时间，发挥持久作用。
(二)常规免疫佐剂 1.铝盐类佐剂
(1)．氢氧化铝胶 简称铝胶。铝胶可用制造各种兽用疫苗。 (2)．明矾 (3)．磷酸三钙 2.弗氏佐剂
弗氏不完全佐剂是由3份液体石蜡油、1份无水羊毛脂、4份磷酸缓冲盐水（pH7.2）混合而成。制造时，先将各成分混合均匀，116℃高压灭菌30min，冷却后加入1％吐温-80混匀，使用时与抗原物质等量混合。
弗氏完全佐剂是在不完全佐剂中加入杀死分枝杆菌或卡介苗，按l～2mg／ml量加入，使用时与抗原物质等量混匀。
细菌性疫苗制造核心技术
