奶牛脂肪来源间充质干细胞的分离培养及其生物学特性研究

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南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2020，51（6）：1462-1469·1462·南方农业学报ISSN2095-1191；CODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com51卷DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2020.06.028奶牛脂肪来源间充质干细胞的分离培养

及其生物学特性研究

罗惠娜，樊全宝，江文康，赵明明，王静静，罗冬章，王丙云*

（佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东佛山

528231）

摘要：【目的】建立奶牛脂肪间充质干细胞（AD-MSCs）体外分离培养体系，并进行增殖能力检测、分化能力鉴定及生物学特性研究，为推广AD-MSCs在畜牧生产及其疾病治疗等方面的应用提供理论依据。【方法】通过I型胶原酶消化法分离奶牛AD-MSCs并进行代传培养，绘制P3、P6和P9代奶牛AD-MSCs的生长曲线及测定其群体倍增时间，分别采用流式细胞术及RT-PCR检测细胞表面标志物；使用干细胞成骨/成脂诱导分化完全培养基进行奶牛AD-MSCs成骨成脂诱导分化，经茜素红和油红O染色后鉴定其成骨成脂分化能力；并检测冻存奶牛AD-MSCs复苏后的存活率。【结果】分离及传代培养获得的奶牛AD-MSCs在体外培养条件下呈长梭形，折光性强，生长状态良好，其生长曲线呈典型的S形，符合Logistic生长规律。奶牛AD-MSCs高表达MSCs表面标志物CD44、CD73、CD90和CD105，但不表达白细胞表面标志物CD45；分别使用干细胞成骨/成脂诱导分化完全培养基诱导的奶牛AD-MSCs经茜素红和油红O染色后，显微镜下可观察到大量的钙结节和红色脂肪滴。冻存6个月后进行细胞复苏，奶牛AD-MSCs的存活率高达96%；复苏奶牛AD-MSCs培养4h内贴壁，呈典型的长梭形，生长状态良好，培养72h细胞融合达80%~90%。【结论】通过I型胶原酶消化法从奶牛腹部脂肪组织分离获得的奶牛AD-MSCs具有良好的体外增殖能力及多向分化潜能，为畜牧生产研究及奶牛疾病治疗提供了一种良好的种子细胞来源。

关键词：奶牛；脂肪；间充质干细胞（MSCs）；生物学特性；体外增殖能力；分化潜能中图分类号：S823.89

文献标志码：A

文章编号：2095-1191（2020）06-1462-08

Isolation，cultureandbiologicalcharacteristicsofdairycow

adipose-derivedmesenchymalstemcells

LUOHui-na，FANQuan-bao，JIANGWen-kang，ZHAOMing-ming，

WANGJing-jing，LUODong-zhang，WANGBing-yun*

（CollegeofLifeScienceandEngineering，FoshanUniversity，Foshan，Guangdong528231，China）

Abstract：【Objective】Thisstudyaimedtoestablishinvitroculturesystemfordairycowadipose-derivedmesenchy-malstemcells（AD-MSCs）andconductproliferationabilitydetection，differentiationabilityidentificationandthebiologi-calcharacteristicsofthesecells，provideatheoreticalbasisforpromotingtheapplicationofAD-MSCsinanimalhusban-dryproductionanddiseasetreatment.【Method】CollagenasetypeIdigestionmethodwasappliedtoseparatedairycowAD-MSCsandthensub-culturedinvitro，andthenplottedthegrowthcurves，determineditspopulationdoublingtimeofP3，

P6andP9generationofAD-MSCs.MembranemarkersofthecellswereidentifiedbyflowcytometricanalysisandRT-PCR.Theabilityofosteogenic/adipogenicdifferentiationwasdetectedbyalizarinredstainingandoilredO，thenlivabilityofAD-MSCsincryopreservedcowmilkafterresuscitation.【Result】TheresultsrevealedthatthecultureddairycowAD-MSCspresentedtypicallongspindleshape，strongrefractivityandfinegrowthstatus.ThegrowthcurveshowedatypicalSshape，whichwasinlinewiththelawofLogisticgrowthcurve.TheMSCssurfacemarkersCD44，CD73，CD90andCD105werehighlyexpressed，whilewhitebloodcellsurfacemarkerCD45wasrarelydetected.AfterbeingstainedwithalizarinredandoilredOusingstemcellosteogenic/adipogenicdifferentiation-inducingcompletemedia，alargenumberofcalciumnodulesandredfatdropletswereobservedunderthemicroscope.After6monthsofcryopreservation，thecellswererecoveredandthecellsurvivalratewasashighas96%.TherecoveredAD-MSCsadheredtothewallafter4hofcul-收稿日期：2020-01-13基金项目：广东省自然科学基金项目（2020A1515011110，2018A030313892，2017A030313171）作者简介：*为通讯作者，王丙云（1963-），博士，教授，主要从事基础兽医研究工作，E-mail：bywang63@163.com。罗惠娜（1994-），

研究方向为基础兽医学，E-mail：1193361927@qq.com

6期罗惠娜等：奶牛脂肪来源间充质干细胞的分离培养及其生物学特性研究

·1463·tureandshowedatypicallongspindleshapewithgoodgrowthstatus.TheAD-MSCswereconfluentby80%-90ˉter72hofculture.【Conclusion】TheAD-MSCsofcowsisolatedfromtheabdomenadiposetissueofcowsbytypeIcollage-nasedigestionmethodhavegoodinvitroproliferationabilityandmulti-directionaldifferentiationpotential，whichpro-videsagoodseedcellsourceforanimalhusbandryproductionresearchandcowdiseasetreatment.

Keywords：dairycow；adipose；mesenchymalstemcells（MSCs）；biologicalcharacteristics；invitroproliferationability；differentiationpotential

Foundationitem：GuangdongNaturalScienceFoundation（2020A1515011110，2018A030313892，2017A030313171）

0引言

【研究意义】间充质干细胞（Mesenchymalstemcells，MSCs）是一种理想的组织工程种子细胞，具有自我更新及分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞及其他胚层细胞的潜能（Samsonrajetal.，2017；刘超等，2019），在多种组织损伤修复与再生方面发挥着重要作用（Cosenzaetal.，2017；Gaoetal.，2017；Wangetal.，2017；Zhengetal.，2017；RadwanandMohamed，2018），是目前应用最广泛的成体干细胞之一。此外，MSCs在体外易于培养，扩增迅速，可分化为多种类型的细胞。因此，加强MSCs生物学特性研究具有重要的临床应用及科学研究意义。【前人研究进展】骨髓和脂肪组织是MSCs的主要来源，其中来源于脂肪组织的MSCs（AD-MSCs）具有来源丰富、易获得、增殖能力强等特点（Wilsonetal.，2019）。近年来，MSCs一直是干细胞研究的热点，有关MSCs的体外培养体系、分化潜能、生物学特性及其应用等已得到深入认识。Palumbo等（2018）研究表明，MSCs可通过细胞间直接接触和旁分泌多种细胞因子，促进其他细胞的增殖或迁移，加速伤口愈合及其他组织的修复；罗冬章等（2019）研究发现，与脐带、羊膜、骨髓来源的MSCs相比，AD-MSCs的体外扩增能力更强，群体倍增时间最短，具有更高的临床应用价值。此外，已有大量临床试验证实，MSCs对自身免疫性疾病及运动系统、泌尿系统、消化系统和心血管系统等多种疾病有良好的治疗效果（BuehrerandCheatham，2013），也可通过MSCs建立大动物模型用于人类和动物的常见疾病研究，同时在提高家畜繁殖力及改造家畜遗传性状等方面均具有重要意义（Hilletal.，2019）。有研究表明，通过回输经药物修饰的MSCs可替换或修复受损的奶牛乳腺组织，并且可增强机体的自身免疫以对抗乳房内感染（Peroniand

Borjesson，2011；Gaoetal.，2014）。在兽医临床学方面，干细胞治疗大家畜骨关节炎的疗效已得到初步证实，其机理在于MSCs具有强大的免疫调节和抗炎作用，能通过细胞间相互作用及多种因子分泌来调节关节局部内环境和活化内源性祖细胞，从而发挥

修复受损软骨的作用（GlennandWhartenby，2014）。

MSCs还可应用于转基因动物生产，培育具有抵抗多种疾病的畜群和研制动物生物反应器，促使转基因动物生产人源α-乳白蛋白等（Donovanetal.，2005；Yangetal.，2011）。【本研究切入点】奶牛作为重要的畜产品来源动物，在畜牧业中扮演着重要角色，而MSCs在奶牛遗传育种、品种改良、抗病研究、奶品质调控、体细胞克隆和转基因技术等领域具有广阔的应用前景（Singhetal.，2010；Capucoetal.，2012；H?eussleretal.，2013），但目前国内有关MSCs的研究主要集中在人类及猪（张庆美等，2015）、犬（Endoetal.，2019）等动物上，针对奶牛MSCs的研究相对较少。【拟解决的关键问题】以奶牛腹部脂肪中的AD-MSCs为研究对象，通过胶原酶消化法分离奶牛AD-MSCs，并进行增殖能力检测、分化能力鉴定及生物学特性研究，以期为推广AD-MSCs在畜牧生产及其疾病治疗等方面的应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1

试验材料

奶牛脂肪组织由广东省佛山市南海区狮山江仔奶牛场提供，取自30日龄荷斯坦小公牛。DMEM/F12基础培养基、青链霉素双抗和0.25%胰蛋白酶购自美国HyClone公司，胎牛血清（FBS）购自以色列Biologi-calIndustries（BI）公司，0.1%I型胶原酶购自Sigma公司，干细胞成脂诱导分化完全培养基和干细胞成骨诱导分化完全培养基购自Cyagen公司，RNA提取试剂盒和反转录试剂盒购自TaKaRa公司，CD90、CD45、CD105和CD44抗体购自Abcam公司。主要仪器设备有超净工作台（苏州苏净仪器自控设备有限公司）、超速低温离心机（美国Beckman公司）、PCR仪（Thermofisher公司）及流式细胞仪（美国BD公司）。1.2试验方法

1.2.1I型胶原酶消化法分离奶牛AD-MSCs及传代培养手术采集奶牛腹部脂肪组织，置于装有10%青链霉素双抗的组织保护液中，低温运回实验室，75%酒精喷洒离心管后转入超净台，后续操作均在无菌条件下进行。晃动离心管以清洗脂肪组织表·1464·南方农业学报51卷面的血细胞2~3次，以含10%青链霉素双抗的PBS浸泡5min后转移至100mm的培养皿中，无菌手术剪将组织剪碎成1mm3，转移至15mL离心管中，0.1%（1mg/mL）I型胶原酶37℃下消化2~3h，直至肉眼无明显可见组织块。组织块与胶原酶体积比1∶3。经100目细胞筛过滤后1000r/min离心5min，弃上清液；以完全培养基重悬，调整细胞密度至1×107Cells/mL，转移至60mm培养皿，置于CO2培养箱中培养。培养体系含DMEM/F12基础培养基、10?S、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素，置于37℃、5%CO2条件下培养48h后，首次半量更换培养基除去大部分血细胞，以后每3d更换一次培养液。倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，此时为P0代奶牛AD-MSCs。待细胞达80%~90%融合时，弃培养液，PBS清洗，经胰酶消化后进行传代培养，此时培养的细胞为P1代奶牛AD-MSCs，以此类推，依次进行消化传代培养。

1.2.2细胞生长曲线制作及群体倍增时间测定分别取处于对数生长期的P2、P5和P8代奶牛AD-MSCs，按5×104Cells/mL的密度接种于24孔板中，每孔0.5mL，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养，随后每天随机消化3孔细胞，按细胞—台盼蓝体积分数比1∶1混匀，Counstar细胞计数仪进行计数。持续8d，取平均值，绘制P3、P6和P9代奶牛AD-MSCs的生长曲线。

根据对数增殖期计算群体倍增时间，Patterson公式为DT=t×［lg2/（lgNt-lgNo）］。式中，t为培养时间，No为首次记录的细胞数，Nt为培养t时间后的细胞数。采用SPSS17.0进行统计分析，组间比较以单因素方差分析（One-wayANOVA）进行检验。

1.2.3表面标志物鉴定采用流式细胞仪鉴定奶牛AD-MSCs表面标志物CD44、CD45、CD90和CD105的表达情况。消化P3代奶牛AD-MSCs，制成单细胞悬液，调整细胞密度至2×105Cells/mL，并转移至1.5mL的EP管中，1000r/min离心5min，弃上清液，PBS清洗细胞，重复离心，连续洗涤2次；分别加入CD44-表1MSCs相关基因扩增引物序列

Table1PrimersequencesforMSCsrelatedgeneamplification

基因GeneCD105CD90CD73CD44CD45

引物序列PrimersequenceF：5'-TGACCGTGAAGGTGGAACT-3'R：5'-TGTGGATGCCGAGGTGAC-3'F：5'-ACCCAGTCATCAGCATCA-3'R：5'-CCGAGGACAGAGGGTGAT-3'F：5'-AGCGAGGACTCCAGCAAG-3'R：5'-ATCCCATTCTTCTAAACAGC-3'F：5'-CCAGAAGGGTGAATACAGAA-3'R：5'-GCAGGCTACAACATCTTCC-3'F：5'-CTACCCAACCTTCTACTCAA-3'R：5'-TTCACATCCAGGAGGTTC-3'

FITC、CD45-FITC、CD90-PE和CD105-FITC一抗稀释液50μL，常温孵育30min后以PBS清洗细胞，离心弃上清液，加入50μLPBS，采用流式细胞术进行测定。1.2.4

总RNA提取、cDNA合成及PCR检测

引物

设计如表1，采用常规PCR检测CD90、CD44、CD73、CD105和CD45等表面标志物的相关基因。取P5代奶牛AD-MSCs，以RNA提取试剂盒提取总RNA，分光光度计检测RNA浓度后反转录合成cDNA，-20℃保存备用。以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增程序：95℃预变性5min；94℃1min，55℃1min，72℃10min，进行30个循环；72℃延伸5min，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。1.2.5

成骨诱导分化

取生长状态良好的P3代奶

牛AD-MSCs，0.25%胰酶消化后，调整细胞密度至1×105Cells/mL，接种于24孔板中，每孔0.5mL。试验分为对照组和诱导组，每组3个重复。置于CO2培养箱培养24h，弃原培养上清液，PBS清洗2遍，试验组加入干细胞成骨诱导分化完全培养基（含FBS、青链霉素双抗、谷氨酰胺、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松），对照组加入含10?S的DMEM完全培养基。每3d更换一次培养液，直至诱导组出现钙结节。40g/L多聚甲醛固定30min，茜素红染液染色10min，PBS清洗后显微镜下观察并拍照记录。1.2.6

成脂诱导分化

取生长状态良好的P3代奶

牛AD-MSCs，0.25%胰酶消化后，调整细胞密度至1×105Cells/mL，接种于24孔板中，每孔0.5mL。试验分为对照组和诱导组，每组3个重复。置于CO2培养箱培养24h，弃原培养上清液，PBS清洗2遍，试验组加入干细胞成脂诱导分化完全培养基A液（含FBS、青链霉素双抗、谷氨酰胺、胰岛素、IBMX、罗格列酮和地塞米松），对照组加入含10?S的DMEM完全培养基。诱导3d后吸走24孔板中的A液，加入0.5mL干细胞成脂诱导分化完全培养基B液，24h后吸走B

扩增片段大小（bp）Amplificationfragmentsize

390

426390400221