类型二：无菌操作技术和接种技术
例2、细菌培养过程中分别采用了高压蒸气、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌 ( )
A．接种针、手、培养基 B．高压锅、手、接种针 C．培养基、手、接种针 D．接种针、手、高压锅 【答案】C
【解析】高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。微生物培养过程中的无菌操作包括消毒和灭菌两大类，分别又有各种不同的方法。对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。 【点评】此题考查学生对无菌技术的掌握。
【举一反三】： 【变式一】
下列操作与灭菌无关的是（ ） A．接种前用火焰灼烧接种环 B．接种前用酒精擦拭双手
C．将平板倒置，放入培养箱中培养 D．接种在酒精灯的火焰旁完成 【答案】C
【变式二】
培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌和消毒方法依次是（ ） ①化学消毒 ②灼烧灭菌 ③干热灭菌 ④紫外线灭菌 ⑤高压蒸汽灭菌 ⑥巴氏消毒法 A．⑤③②①④⑥ B．①②③④⑤⑥ C．⑥②③④①⑤ D．③④②①⑥⑤ 【答案】A
【变式三】
关于平板划线操作正确的是（ ）
A．使用已灭菌的接种针、培养皿，在操作过程中不再灭菌
B．打开含菌种的试管，需通过火焰灭菌，取出菌种后，需马上塞上棉塞 C．将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线即可 D．最后将平板倒置，放在培养箱中 【答案】D
【解析】在平板划线时，已灭过菌的接种针在每次划线后，都必须用灼烧灭菌法灭菌，以防杂菌污染，A错；盛有菌种的试管在打开或重新塞棉塞前，都需通过火焰灼烧灭菌，B错；在划线过程中，培养皿盖应打开一条缝隙，进行接种，接种完毕后，迅速盖上培养皿盖，以防止杂菌污染，C错；平板凝固后，须将平板倒置。
类型三：利用选择培养基筛选菌株的实验方法和步骤 例3、探究如何从土壤中分离自生固氮菌与计数。 实验原理
农田的表层土壤中，自生固氮菌的含量比较多。将用表层土壤制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下。只有自生固氮菌才能生长繁殖。用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离开来。 材料用具
农田的表层土壤、无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、盛9 mL无菌水的大试管若干。无菌移液管、无菌涂布器、无菌培养皿、盛90 mL无菌水的锥形瓶、酒精灯、恒温箱。 方法步骤
（1）倒平板。分别将无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，应在________操作。 （2）制备土壤稀释液。取土样10 g加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。用无菌移液管吸取上清液1 mL，转至9 mL无菌水的大试管中，依次稀释到107倍稀释度。为实现无菌操作，试管口和移液管应在离火焰________cm处。
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（3）涂布。按照由10～10稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布，每个稀释度下，无氮培养基应至少涂布________个平板，牛肉膏蛋白胨培养基涂布________个平板。 （4）培养放人恒温箱内，在适宜温度条件下培养3 d～4 d。一般每隔________小时统计一次，选取________时的记录作为结果，这样可以防止________。
（5）细菌的计数。当菌落数目稳定时，选取菌落数在________的平板进行计数。如果测试的平均值为50，
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则每克样品中的菌落数是________。（稀释度是10）
（6）预期结果。相同稀释度下，牛肉膏蛋白胨平板上的菌落数________（填“多于”或“少于”）无氮培养基上的数目。理由是________。 【答案】
（1）酒精灯火焰旁 （2）1～2 （3）3 1
（4）24 菌落数目稳定 因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
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（5）30～300 5×10
（6）多于 无氮培养基上可以生存和繁殖的只是土壤中的固氮菌，而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类的生存
【解析】考查微生物的分离及计数。要分离自生固氮菌，采用选择培养基分离的方法，缺乏氮源的培养基可用来分离自生固氮微生物，而其他微生物因缺乏氮源不能生长。实验步骤一般是：配制无氮培养基→灭菌→倒平板→系列稀释→涂布平板→培养→观察并计数。实验中要注意无菌操作和设计对照实验等。 【点评】本题考查微生物分离实验中对照实验的设计。 【举一反三】： 【变式一】
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用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为10的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是（ ）
A．涂布了2个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是2l、212和256，取平均值163 D．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233 【答案】D
【解析】 在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，所以A、B不正确。C项虽涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另两个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单用3个平板的计数值来求平均值。
微生物的培养与应用知识讲解
