荧光原位杂交技术检测43例慢性淋巴细胞白血病患者基因
异常
荆源，林樉，王芳婷，于家文，姜凤*
【摘 要】摘要 目的：探讨荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术对慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）诊断及预后评估的价值。方法：应用常规R显带方法对43例CLL患者进行染色体核型分析，同时应用FISH技术对43例CLL患者的D13S25、RB1、ATM、P53和CEP 12基因进行检测分析。结果：43例CLL患者染色体异常检出率为9．3%（24/43），涉及数目异常和结构异常，异常染色体涉及2号、6号、14号和性染色体。染色体核型正常的患者较多，占79．1%，同时有5例CLL患者未见分裂象。FISH阳性检出率为55．8%，其中D13S25基因缺失阳性率最高，占37．2%；其次依次为RB1基因缺失阳性检出率为20．9%，CEP 12基因扩增阳性检出率为16．3%，ATM基因缺失阳性检出率为9．3%，P53基因缺失阳性检出率为7．0%。在24例FISH阳性的患者中，有20例患者染色体核型正常，3例未见分裂象，只有1例染色体核型异常，但并不涉及FISH检测出的阳性基因。结论：FISH技术能够大大提高CLL患者细胞遗传学异常的检出率，是CLL患者遗传学检测的重要手段，但由于检测的探针数量有限，对于CLL患者仍需使用FISH技术结合染色体核型分析来提高细胞遗传学异常的检出率，为CLL的临床诊断及预后判断提供依据。 【期刊名称】中国实验血液学杂志 【年(卷),期】2018(026)004 【总页数】6
【关键词】关键词 荧光原位杂交；慢性淋巴细胞白血病；染色体 2017-04-20收稿；2017-06-15接受 JExp Hematol2018；26（4）：1038-1043
慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）是一种原发于造血组织的低度恶性的淋巴细胞增殖性疾病，95%的肿瘤细胞为单克隆的B淋巴细胞。此病多见于老年患者，其发病机制尚不清楚，临床表现及预后具有明显的异质性，因此在CLL发病早期对患者进行预后评估则显得尤为重要［1］。约有近半数的CLL患者具有克隆性的细胞遗传学异常，这些异常的有无及其类型与CLL的预后相关。由于CLL的白血病细胞有丝分裂活性低下，染色体核型分析大多为正常核型，或者没有分裂象无法进行分析，而采用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术不但能够克服上述缺点，还可以提高部分染色体异常的检出率，因此FISH技术已经成为CLL诊断及预后判断的重要检测手段。本研究采用 D13S25、RB1、ATM、P53和CEP12五种探针，应用FISH技术对43例CLL患者进行基因检测及染色体核型分析，探讨CLL患者的细胞遗传学及分子遗传学特征。
材料和方法
研究对象
2010年10月至2017年1月在大连医科大学附属第一医院门诊或住院确诊的CLL患者43例，其中男28例，女15例，中位年龄65（41-86）岁。CLL的诊断符合《血液病诊断及疗效标准》［2］。正常对照组取自同期20例染色体核型正常的非血液系统恶性疾病患者的骨髓标本。实验用样本的采集均经受试者知情同意。
试剂与仪器
秋水仙酰胺购自美国Sigma公司；CLL基因检测探针试剂盒（包括 D13S25、RB1、ATM、P53和 CEP 12五种探针）和复染剂DAPI均购自北京金菩嘉医疗科技有限公司；荧光显微镜购自德国Zeiss公司。 常规细胞遗传学分析
全部病例均采用不加任何刺激剂的骨髓细胞短期培养法于37℃培养24 h或48 h，收获前1 h加秋水仙酰胺（终浓度为 0．05μg/ml），低渗 35 min，用固定液（甲醇∶冰乙酸 ＝3∶1）固定3次，细胞悬液制片，R显带姬姆萨染色后进行核型分析。核型描述按照《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN 2013）》。 FISH检测
将部分细胞冻存于 -20℃冰箱中。实验应用前用新鲜固定液洗3次，滴片后气干。玻片在室温条件下2×SSC中处理10 min，取出梯度乙醇（70%、85%、100%）脱水各 2 min，气干。将配好的D13S25、RB1、ATM、P53和 CEP 12 5种探针（表 1）分别滴加在玻片上，盖上盖玻片，并用封片胶封好四周，置于原位杂交仪中73℃变性5 min，37℃杂交6-16 h，快速洗脱样本，每个样本加入DAPIⅠ（金菩嘉）10μl后，盖上盖玻片，于暗室中复染20 min。 FISH信号采集分析
应用荧光显微镜（ZEISS Imager A1，德国），采集在DAPI/FITC/TRITC三色滤光镜激发下的间期细胞荧光信号，并用全自动数码照相机采集图像，并输入计算机进行图像处理。其中采用D13S25探针检测基因缺失，用红色（R）荧光素标记，正常细胞信号为2R（附图A），阳性细胞信号为1R或0R（附图B）；采用RB1探针检测基因缺失，用绿色（G）荧光素标记，正常细胞信号为2G
荧光原位杂交技术检测43例慢性淋巴细胞白血病患者基因异常
