答案仅供参考
第二章
一、名词解释：
1、DNA变性：DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。
2、DNA复性：变性DNA 在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。
3、退火：指模板双链DNA经热变性，螺旋解开成单链后，通过缓慢冷却到55℃左右，使引物(即具有互补碱基的RNA片段)与该模板DNA单链重新配对，形成新的双链分子的过程。
4、DNA芯片：是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。
5、基因诊断：又称DNA诊断或分子诊断，通过分子生物学和分子遗传学的技术，直接检测出分子结构水平和表达水平是否异常，从而对疾病做出判断。
6、酶活性单位：1单位限制性内切酶（1 U）通常定义：在建议使用的Buffer及温度下，在20ml（50ml）反应体系中反应1小时，使1g入DNA完全消化所需的酶量。
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7、星活性：在非最适的反应条件下，酶的识别特异性降低，产生非特异性带，这种酶切特异性降低的现象，称为星活性。
8、平台效应：反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期 ，这种现象称为平台效应。 二、简答题
1、影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？ 1）连接所用的目的片段的状态：
1 效率：粘性末端>平端(100倍)； 1 5，突出>3，突出；
1平端：HaeIII>AluI>HinCII>SmaI 2）连接温度
1连接效果最好在37 ℃，但形成的互补不稳定;
1最佳连接温度：12-16 ℃，较好的连接效果，互补又较稳定;
3）反应液中的成分：
1 ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，连接缓冲液宜分装；
1单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果； 1 PEG：5%以下可以提高连接效率 4）插入片段与载体的浓度比例
1载体DNA与外源DNA的分子摩尔比通常为1﹕3左右，甚至1﹕10 或更高。
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1目的或作用：增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。
6、建议放在4度冰箱连接两天效率更高比14度好 2、什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素影响？
答：Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星号活性。 概括起来，诱发星活性的因素有如下几种： (1)高甘油含量(>5％, v／v)；
(2)限制性内切核酸酶用量过高(>100U／ugDNA)； (3)低离子强度(<25 mmol／L)；
(4)高pH(8.0以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等； (6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。 3、影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些？
答：（1）DNA的纯度 （2）DNA甲基化的程度 （3）酶切消化反应的温度 （4）DNA的分子结构 （5）核酸内切限制酶的缓冲液
4、细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同？在基因工程中有什么用途？
答：主要差别是：CIP68°C时失活，而BAP68°C稳定，且耐酚抽提。应用：
(1)dsDNA的5'端脱磷酸，防止DNA的自身连接。但是用CIP处理后，最好将CIP除去后，再进行连接反应。
(2)DNA和RNA脱磷酸，然后用于多核苷酸激酶进行末端标记。 5、PCR的基本原理是什么？用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息？
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答：)DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。 (2)至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。 6、怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoR I限制位点中去？
答：化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中。
7、黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出这些不足之处。
答：黏性末端连接法不足之处有：(1)载体易自身环化；(2)若是用同一种限制性内切核酸酶产生的黏性末端连接又不易定向克隆；(3)难插入特定的基因；(4)再者就是大片段DNA的重组率较低，即使用碱性磷酸酶处理了载体，防止了载体的自身环化，载体也有成环的倾向；(5)用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不止一个载体连接起来的串联重组体，增加筛选工作的困难。
8、什么是同聚物加尾连接法？用何种方法加尾？具有哪些优缺点？ 答：所谓同聚物加尾法就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3’端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如dA(dG)和dT(dC),然后在DNA连接酶的作用下涟接成为重组的DNA。这种方法的核心是利用末端转移酶的功能，将核苷酸转移到双链DNA分子的突出或隐蔽的3'-OH上。以Mg2+作为辅助因子，该酶可以在突出的3'-OH端逐个添加单核苷酸，如果用Co2+作辅助因子则可在隐蔽的或平末端的3'-OH端逐个添加单个核苷酸。
同聚物加尾法实际上是一种人工黏性末端连接法，具有很多优点：．(1)首先不易自身环化，这是因为同一种DNA的两端的尾巴是相同的，所以不存在自身环化。(2)因为载体和外源片段的末端是互补的黏性末端，所以连接效率较高。(3)用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法
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进行连接。同聚物加尾法也有一些不便之处：(1)方法繁琐；(2)外源片段难以回收。由于添加了许多同聚物的尾巴，可能会影响外源基因的表达。另外要注意的是，同聚物加尾法同平末端连接法一样，重组连接后往往会产生某种限制性内切核酸酶的切点。 9、何谓接头连接法？
答：将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切核酸酶的识别序列)，加到载体或外源DNA的分子上，这样便在载体DNA和外源DNA上制造出新的酶切点。把这一小段含有酶切点的DNA分子称为连接器分子，这种方法称为接头连接法。 10、一般质粒DNA的构型有哪几种？在琼脂糖凝胶电泳中的有何特点？ 超螺旋质粒DNA、开环质粒DNA、线状质粒DNA
在琼脂糖凝胶电泳的特点是：电泳的泳动速度由大到小分别是： 超螺旋质粒DNA>线状质粒DNA>开环质粒DNA
11、碱裂解法提取质粒DNA的原理，分析影响试验结果的各种可能因素。 碱裂解法原理：在碱性条件下，双连DNA氢键断裂，结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分变性。在中性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈不溶物而经离心除去。 提取失败：1）洗去双链时，将质粒DNA洗去；
2）破壁失败，质粒没析出； 3）加剂问题
电泳失败：1）电压太高 2）没加染色剂 3）胶穿孔 4）电泳时间过长
12、电泳缓冲液使用一定时间后出现DNA在凝胶中跑不动现象的原因，有何解决办法？
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