乳酸杆菌分离鉴定技术的研究

乳酸杆菌分离鉴定技术的研究

乳酸杆菌 (Lactoba ill r i n c k)属于硬壁菌门( Firmicutes) 杆菌纲 (Bacilli) 乳酸杆菌目(Lactobacillales) 乳酸杆菌科 (Lactobacillaceae)， 能发酵葡萄糖(或利用碳水化合物) 产生大量乳酸，广泛分布于环境，特别是动物的消化道、尿道，蔬菜和食品中，具有调节肠道菌群 、 预防或缓解胃肠道疾患、增强机体免疫功能、减少心血管病发病率、降低与酒精中毒性肝

病相关 的内毒素作用等有益于人体健康的诸多生理功能。近年来广泛应用于保健品、药物、 果汁、糖果、冰淇淋的研发，某些乳酸杆菌尚被用于疾病的辅助治疗。2005年初，乳酸杆菌共有100个种，而到了2007年则多达12个种。鉴于乳酸杆菌种类的多样性，来源的多渠道，可用于生产食品类别和形式的广泛性，食用人群的敏感性等，使乳酸杆菌的安全状况越来越受到公众的关注。值得指出的是，乳酸杆菌的作用具有证种内所有菌株均安全，因此正确对乳酸杆菌分离鉴定是保证其产品食用安全性的重要基础，本文就乳酸杆菌分离鉴定的最新研究进展进行综述。

1 乳酸杆菌的分离

从不同的基质中分离乳酸杆菌时，根据乳酸杆菌所在生境的不同以及是否为优势菌可选择 不同组分的培养基。目前比较常用的培养基有MRS培养基、 RS MA培养基、番茄汁琼脂培养基等。

1．1 MRS培养基

当乳酸杆菌是待分离区系的优势菌时，常用MRS培养基对其进行分离。一些常见的食品污染菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等在MRS培养基上生长较差或几乎不生长，从而减少了杂菌的污染，降低了分离难度。目前MRS培养基已经成为国标上公认的用于乳酸杆菌分离较好的培养基。常用于从乳酸杆菌发酵制品中分离菌种以及菌种分离后的传代培养。

1.2.RSMA培养基

RSMA培养基是近几年发展起来用于乳酸杆菌分离的一种非选择性培养基，由于该培养基中加入0.05％的钉红染料，因此其最大优点是可以使不同菌种在其表面生长并形成颜色各异 易于鉴别的菌落。通常情况下，乳酸杆菌在RS MA培养基上形成 黄色菌落，而嗜热链球菌为紫红色菌落，肠球菌是白色菌落。因此，简单培养后不用通过常规染色和镜检就可以将乳酸杆菌与其他细菌鉴别开来。ELLI等应用RSMA培养基成功的从人粪便样品中分离出了乳酸杆菌。由于此培养基的营养成分比较单一，所以不适于从菌群组成复杂的环境中分离乳酸杆菌。

1.3 番茄汁琼脂培养基

这是一种传统的用于分离乳酸杆菌的培养基，此种培养基由于含有一定量的番茄汁，为乳酸杆菌的生长提供必要的营养，使得乳酸杆菌在此环境下更容易生长。但由于配置过程中需要制备新鲜番茄汁，所以操作起来较为费时费力，目前已逐渐被 MRS等培养基所代替。

1.4 其他培养基

某些选择性培养基可用于从菌群复杂的基质 (例如肠道) 内进行乳酸杆菌的分离。APT( All Purpose Tween) 培养基通常用于从肉制品中分离乳酸杆菌，改良的Rogosa SL( Rogosa Sodium Lactate Modified ) 完全选择性培养基则常用于胃肠内容物中乳酸杆 菌的分离。Briggs琼脂培养基和s L( Sodium Lactate) 培养基常用于酸奶中乳酸杆菌分离。

2 乳酸杆菌的鉴定 2.1 属水平的鉴定

乳酸杆菌属水平的鉴定是乳酸杆菌整体鉴定过程中较为简单且最为基本的步骤。常用的方法是对分纯后的乳酸杆菌培养物进行革兰染色、镜检，选择无分叉的G杆菌。如果这些无分叉G杆菌经过培养后，在p H 4.5的条件下能够生长并且过氧化氢试验、硝酸盐还原验、 联苯胺反应、明胶液化试验、吲哚试验、硫化氢试验均为阴性即可鉴定其为乳酸杆菌属。

2.2 种水平的鉴定

2.2.1 生化鉴定 乳酸杆菌种水平的生化试验主要采用糖醇类发酵试验。不同乳酸杆菌对糖的利用情况不一，以此可作为种水平鉴定的依据。传统的生化鉴定方法是配制各种特异性生化反应管，该方法虽然成本较低。但费时费力，不适于大批量样品的快速鉴定，并且反应管种类较少所以结果的判定受限制。近年来， 法国梅里埃公司研发的API S OCH／CHL鉴定 系统试验卡是由4 9种可发酵碳水化合物组成的简易培养基， 接种菌后反应48h即可直读 结果。由于乳酸杆菌发酵碳水化合物产酸导致p H值下降使指示剂变色，所以结果极易判别。AP I 50CH／ CHL鉴定系统是目前国内外应用最广泛、结果准确可靠的快速生化鉴定系统。缺点是价格昂贵，不适于大规模菌种的鉴定。

2.2.2 基因鉴定

2.2.2.1 P C R．随机扩增多态性DNA (PCR．randomly amplified polymorphic DN A，PCR．RAPD) RAP技术是在2O世纪8 O年代末90年代初发展起来的一种新的、 能够全面系统地探索基因组功能的强有力高新技术工具，通过对PCR产物的分析检测， 以获得基因组DN在待测区域内的多态性进行鉴别，目前RAPD．PCR技术已成为乳酸杆菌鉴定技术的发展趋势。2006年RANTSIO等利用RAPD技术对从发酵肉制品中分离出的三种乳酸杆菌进行了分类，成功的将 69株弯曲乳酸杆

菌归为7类， 69株植物乳酸杆菌归为lO类， 173株清酒乳酸杆菌归为23类。有报道指出，若将 RAPD技术与生化反应结果相结合可更准确地鉴定乳酸杆菌。R APD具有快速、简便、成本相对较低、特异性强等特点，尤其对于鉴别亲缘关系较近的细菌更为有效，缺点是需要相关的标准菌株做参比。

2.2.2.2 限制性片段长度多态性PCR( PCR ． restriction f ragment length polymorphism， PCR - Rna) RFL是一种全基因组方法，它作为第一代分子生物学方法在过去的几年被广泛应用于微生物的鉴定，目前，也被广泛应用于乳酸杆菌的分类及鉴定。已发表文献中包括针对乳酸杆菌内特定基因进行特异扩增的PC方法， 如针对t u f(encoding for elongation factor Tu) 基因PC方法可以将包括德氏乳酸杆菌德氏亚种、德氏乳酸杆菌保加利亚亚种、德氏乳 酸杆菌嗜酸亚种、嗜酸乳酸杆菌、约氏乳酸杆菌、 瑞士乳酸杆菌、 发酵乳酸杆菌等15种乳酸杆菌进行鉴别]。针对mal( malolactic enzyme ) 基因的PCR法可以将包括唾液乳酸杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、植物乳酸杆菌、 乳酸乳酸杆菌、 短乳酸杆菌等9种乳酸杆菌鉴别开来。前不久BLAIOTTA等针对乳酸杆菌的hsp6 0(heat-shock protein)基因进行特异性PCR．RF LP扩增，结果对包括干酪乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌、 植物乳酸杆菌、 鼠李糖乳酸杆菌、 弯曲乳酸杆菌、 瑞士乳酸杆菌、发酵乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌等43种乳酸杆菌进行明确的鉴定。RFLP的主要优点在于操作简便、快速，终点判断准确，缺点是酶的选择困难。通常情况下， 这种方法需要两种或两种以上的酶相结合方可对诸多菌种进行鉴别，所以在酶的选择上需要较高的专业知识水平，并且部分酶价格昂贵，因此实验成本较高。

2.2.2.3 PCR一变性梯度凝胶电泳 (PCR．denaturing g radient

gelelectmphoresis。PCR．DGGE)PCR．DGG最初被用来监测基因突变。后来被广泛的应用于微生物研究，目前国外已将该技术已广泛用于食品中乳酸杆菌菌株的筛选、分组、鉴定以及对食品品质评估 和质量控制。TABASCO等2007年用PCR．DGGE技术成功的将发酵奶制品中的保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌、类干酪乳酸杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌等进行了鉴别， FONTAN等也用同样的技术将真空包装牛肉中的清酒乳酸杆菌、弯曲乳酸杆菌、 冷明串珠菌区分出来。由于PCR．DGGE可以区分含碱基成分不同而片段大小一致的DN A序列，甚至一个碱基对的不同都会引起DN A片段停留于凝胶的位置各异，所以与传统乳酸杆菌的鉴定技术相 比，具有快速、全面的特点。同时DGGE技术也有其限制性，主要表现在：① 只能分离较小的片段(最长达1 0 0 0 b p) ，因此提供的信息有限，片段太长时解离率下降。②DGG在种水平上鉴定细菌菌群结构有限。③依据16S r DNA的DGGE研究菌群多样性，由于某些种类16 Sr DNA的拷贝之间的异质性问题及异源核酸双链分子的检出可能会导致自然菌群 中细菌数量的过多估计。

2.2.2.4 多重PCR( multiplex PCR) 由于乳酸杆菌种类繁多，菌群组成复杂， 因此传统的PCR方法难以达到多种乳酸杆菌快速同时鉴定的目的， 这一不足可以通过在单一反应中同时扩增多个位点的多重PCR预以弥补。由于多重PCR同时扩增多个目的基因，具有节省时间、 降低成本、提高效率的优点，所以一经提出即得到研究者的青睐，并且发展迅速，现已成为乳 酸杆菌分类鉴定的一项成熟而重要的研究手段。已有学者利用这项技术同时将嗜酸乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌、德氏乳酸杆菌、 瑞士乳酸杆菌、 鼠李糖乳酸杆菌、 植物乳酸杆菌区 分开来。其它一些乳酸杆菌如短乳酸杆菌、发酵乳酸杆菌、 希氏乳酸杆菌、 食果糖乳酸杆 菌等都可以应用多重PCR方法进行一次性鉴别。该技术的难点在于引物的设计和PCR扩增条件的标准化等，此外，对操作者技术要求较高并且多重PCR的结果特异性较差。

2.2.2.4 多重PCR(multiplex PCR)由于乳酸杆菌种类繁多，菌群组成复杂， 因此传统的P CR方法难以达到多种乳酸杆菌快速同时鉴定的目的，这一不足可以通过在单一反应中同时扩增 多个位点的多重PCR预以弥补。由于多重PCR同时扩增多个目的基因，具有节省时间、降低成本、提高效率的优点，所以一经提出即得到研究者的青睐，并且发展迅速，现已成为乳 酸杆菌分类鉴定的一项成熟而重要的研究手段。已有学者利用这项技术同时将嗜酸乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌、德氏乳酸杆菌、 瑞士乳酸杆菌、 鼠李糖乳酸杆菌、 植物乳酸杆菌区 分开来。其它一些乳酸杆菌如短乳酸杆菌、发酵乳酸杆菌、希氏乳酸杆菌、食果糖乳酸杆菌等都可以应用多重PCR方法进行一次性鉴别。该技术的难点在于引物的设计和PCR扩增条件的标准化等，此外，对操作者技术要求较高并且多重PCR的结果特异性较差。

3 展望

由于乳酸杆菌对人体的作用存在株的差异，同一种内不同株间其功能和特性各异，因此对 于乳酸杆菌种株水平鉴定技术的研究已成为国内外研究的焦点，也是确保含有乳酸杆菌食品安全性的重要保障。目前，各种核酸技术在乳酸杆菌鉴定中的应用都还处于探索性阶段且各有优缺点，PCR方法只能够对一部分乳酸杆菌进行鉴别，PFGE分型方法中仍然存在着不能被鉴定的同源性菌株，未来的研究中发展和完善现有的核酸分型技术，创建更新更完备的分 型鉴定方法将是各国学者潜心研究的重点。目前，基因芯片技术发展迅速，并越来越多的应用于微生物的分型和鉴定，在各种核酸分型鉴定技术成熟稳定后，建立乳酸杆菌的基因芯片技术将指日可待。