大学生研究训练(SRT)计划项目申请书(幅面，16K) - 图文

2 mg·L+ NAA 0.5 mg·L+ 蔗糖 30 g·L+ 琼脂 8 g·L。 3.分化培养基 -1 -1 -1 -1 MB0 + 水解酪蛋白 500 mg·L+ 谷氨酰胺 200 mg·L+ 天门冬酰胺 150mg·L + KT 5 mg·L-1 -1+ 蔗糖 30 g ·L+ 琼脂 8 g·L。 4.生根培养基 -1 -1 1/2 MB0 + 蔗糖 30 g ·L+ 琼脂 8 g·L。 5.共培养培养基 -1 诱愈培养基附加 AS 200 μmol·L。 6.选择培养基 -1 分化培养基附加 卡那霉素(Km) 50 mg·L。 7.抑菌培养基 -1 分化培养基或生根培养基附加 Cef 200 mg·L。 8.农杆菌培养用培养基 YEB 培养基用于农杆菌培养，每升含： 细菌培养用酵母提取物 1 g 细菌培养用胰蛋白胨 5 g 牛肉膏 5 g 蔗糖 5 g MgSO4 ·7H2O 0.5 g -1-1 -1 附加 Km 50 mg·L 、Rif 25 mg·L；加 15 g·L琼脂可配成 1.5％的固体培养基。 实施计划与路线： 收取小麦种子→种子表面消毒 →诱导胚性愈伤组织 →菌液侵染 →共培养 →洗菌→抗生素筛选 →分化成苗 →炼苗并得到再生植株 → DNA提取 →PCR检测。 ⒈ 收取小麦种子：选取成熟饱满、颜色和大小相对一致的小麦成熟种子。 ⒉ 种子表面消毒：用 70％(v/v) 酒精浸泡 10 min，无菌水冲洗 2～3 次，再经 0.1％的升汞（HgCl2）浸泡 20 min，无菌水冲洗 6～8 次。 ⒊ 诱导胚性愈伤组织：在26℃的黑暗条件下用去离子水浸泡 16～20 h，待种子露白，用镊子撕破种皮，破坏胚芽和胚根，剥出种胚，盾片朝上接种在诱愈培养基上（以上各步均在超净工作台中进行），25±1℃暗培养 15 d。 4．菌液侵染： ⑴浸染液的准备： ①挑取含目的质粒的农杆菌单菌落于 2 ml 含 50 mg·L-1 Km 的 YEB 培养基中，28℃、170 rpm 暗培养过夜；② 吸取 1 m1 培养物转入 30 ml 含 50 mg·L-1 Km 的 YEB 培养基中，28℃、170 rpm 继续暗培养至OD600=0.6～1.0；③ 将菌液转至无菌离心管中，6000 rpm 离心 10 min；④ 菌体沉淀用 MB0 液体培养基洗涤一次后，再用 MB0 液体培养基重悬，使重悬菌液 OD600=0.4～1.0；⑤重悬菌液中加入终浓度为 200 μmol·L-1 的 AS，用于侵染小麦外植体。 ⑵侵染小麦的步骤： ①将胚性愈伤组织放置于附加 AS 200 μmol·L-1 的预培养基（或培养液）上，26±1℃黑暗条件下预培养 3 d ；②用重悬的 接种菌液，在 26±1℃黑暗条件下侵染小麦外植体，其间进行农 杆菌浸染浓度和时间处理； 5．共培养： 取出侵染后的外植体，用无菌滤纸吸去多余菌液，放置在共培养培养基上，26±1℃黑暗条件下共培养； 6．洗菌及抗生素筛选：取出外植体，用 500 mg·L-1 的 Cef 抑菌液浸泡 10 min，无菌水冲洗 4-5 次，置于选择培养基上，26±1℃暗培养 2 周左右，随后进行 16 h / 8 h（光/暗）光照培养（光照强度为 40 μmol·m-2·s-1）；选择培养进行 30d，然后移至抑菌培养基； 7．分化成苗，炼苗并得到再生植株：分化出来的抗性绿芽长至 3 cm 左右时，移至抑菌生根培养基，具有正常根系的再生植株长至 6-8 cm 时，春化，练苗，移栽至花盆，生长至成熟。 -1 -1 -1 -18．DNA提取及PCR检测：提取基因组DNA进行PCR检测。 可行性分析： 1、本人已经了解了植物组织培养、农杆菌介导的遗传转化和转基因植株后代遗传分析的基本原理及相关的试验操作技术。 2、已初步进行了基因型的筛选，通过预试，筛选出成熟胚再生频率较高的材料。 3、在预试过程中已初步建立了农杆菌介导的小麦遗传转化体系，为进一步开展转基因研究奠定了基础。 4、本实验拟在国家小麦改良分中心实验室进行，该实验室设备齐全，仪器先进，经费充足，并且有多年从事小麦育种工作实验的专家、教授作指导，为实验的正常开展和顺利进行提供了保证。 参考文献: [1]陈立国, 后猛等.农杆菌介导小麦成熟胚遗传转化研究[J].麦类作物学报,2007,27(2):188–193. [2]刘万代,尹钧等.转基因技术在小麦遗传改良中的应用[J].中国农学通报, 2006, 22:(7):69–73. [3]柳建军,于洪欣等.小麦成熟胚愈伤组织诱导及分化的研究[J].山东农业大学学报,1996, 27(4):451–456. [4]蔡润,中田和男等.小麦根愈伤组织胚胎发育过程研究[J].西北植物学报, 2000, 20(1): 48–53. [5]陈淑仪. 运用PCR技术鉴定转基因玉米.Educational Equipment and Experiment Vol.24,No.5,2008 [6] 胡林双，何云霞，郭 梅，王晓丹，闵凡祥等. 应用PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌. 中国马铃薯，第20卷，第4期，2006 [7]柯遐义,陈春洪等.影响麦成熟胚培养的几种因素研究[J].广东农业科学,1995, 6:12–14. [8]刘庆法,唐克轩等.农杆菌介导的小麦遗传转化条件的研究[J].复旦学报(自然科学版),1998, 37(4):569–572. [9] 张 平 左示敏 李爱宏 张亚芳 陈宗祥 潘学彪等. 提高农杆菌转化水稻频率几个因素的研究. 中国水稻科学(Chinese J Rice Sci)，2004．18(1)：u～15 [10]刘万代,尹钧等.转基因技术在小麦遗传改良中的应用[J].中国农学通报, 2006, 22:(7):69–73. 四、预期成果 完善农杆菌介导的小麦遗传转化体系，利用本实验室构建的磷高效基因表达载体pTaPHR1进行遗传转化，将小麦磷高效基因TaPHR1转入小麦中，并对转基因后代进行分析鉴定，获得磷高效转基因后代。 五、本项目的特点与创新之处 特点： 1、完善小麦离体再生培养技术体系，进一步研究农杆菌介导小麦遗传转化技术体系，为小麦转基因研究奠定良好基础。 2、获得磷高效转基因后代，并进行鉴定，为进一步的磷高效基因的功能分析和育种工作做基础。 创新之处： 1、前人的研究多集中于施磷对小麦产量和品质的影响方面，而较少考虑如何利用小麦自身的生理、遗传特点，挖掘其利用土壤及肥料磷素的潜力。本实验通过对小麦磷高效基因TaPHR1的遗传转化研究，提高土壤及肥料磷素的利用率。在理论上有重要创新。 2、前人在品种选育上较注重对产量、品质性状及抗性性状的考察和研究，较少考虑其资源利用效率的遗传性状。本实验通过小麦磷高效基因的转化，得到的转基因植株对于提高土壤磷素资源利用效率，实现小麦优质高产高效生产有重要意义，在技术上有一定创新。 六、项目研究基础 主持人与本项目相关的专业知识积累和已取得的成绩。 指导教师的教学、科研工作积累和已取得的工作成绩。 项目组成员的学习情况。 指导教师王洪刚：主要从事现代生物技术与作物遗传改良的理论及应用研究，以小麦的多种近缘野生物种和人工合成的双倍体为材料进行了外源基因的鉴定、功能分析、转移及分子标记等研究，将小麦多种不同近缘物种的染色体组、染色体或染色体片段转移进小麦；创造了多种双倍体、非整倍体材料和一批各具特色的新种质及小麦新品系；其中三个小麦新种质入选国家种质库，3个小麦新品系正参加山东省区域试验；对小麦谷蛋白优质亚基进行了鉴定、标记、聚合；对多种外源染色体在小麦遗传背景中的传递特点、多种重要性状的遗传规律进行了分析；初步鉴定出3个新的功能基因。主要科学研究工作简历：1995年, 从事人工合成偃麦草多种双体附加小麦新种质的研究, 获得山东科技进步二等奖；1997年, 利用小麦异附加系创造优质多抗冬小麦新品系的研究, 获得山东科技进步二等奖；2001年, 小麦抗病基因多样化和综合抗病种质的创性研究,获得山东科技进步三等奖。 许艳艳：08级学生，学过的课程有：《植物学》《无机及分析化学》《有机化学》《基础生物化学》《土壤肥料学》《农业信息技术》等，取得较好的成绩。大学一年来，做过上述课程实验，尤其掌握了动植物总DNA提取、PCR扩增技术及DNA的琼脂糖凝胶电泳等实验技术，具备一定的动手能力。高中时对基因工程有了初步的学习，并自学了《分子遗传学》。自09年9月以来，一直跟随农学院研究生李国瑜做农杆菌介导小麦遗传转化若干影响因素的研究实验，掌握了基本培养基、诱愈培养基、分化培养基等培养基的制备技术，熟练了小麦剥胚技术等，对科研充满了浓厚的兴趣。曾获得过专业一等奖学金、学习单项奖、国家励志奖学金，现在在植物科技协会担任花卉小组组长。 李震震：08级学生，学过的课程有：《植物学》《无机及分析化学》《有机化学》《基础生物化学》《土壤肥料学》《农业信息技术》等，取得较好的成绩。自09年9月以来，一直跟随农学院研究生李国瑜做农杆菌介导小麦遗传转化若干影响因素的研究实验，掌握了基本培养基、诱愈培养基、分化培养基等培养基的制备技术，熟练了小麦剥胚技术等，对科研兴趣极大。曾获得专业二等奖学金、校三好学生。 张超：08级学生，学过课程有：《植物学》《无机及分析化学》《有机化学》《基础生物化学》《土壤肥料学》《农业信息技术》等，取得的成绩较好。自09年9月以来，一直跟随农学院研究生李国瑜做农杆菌介导小麦遗传转化若干影响因素的研究实验，掌握了基本培养基、诱愈培养基、分化培养基等培养基的制备技术，熟练了小麦剥胚技术等，对科研兴趣特别大。 王欣：08级学生，学过课程有：《植物学》《无机及分析化学》《有机化学》《基础生物化学》《土壤肥料学》《农业信息技术》等，取得的成绩较好。自09年9月以来，一直跟随农学院研究生李国瑜做农杆菌介导小麦遗传转化若干影响因素的研究实验，掌握了基本培养基、诱愈培养基、分化培养基等培养基的制备技术，熟练了小麦剥胚技术等，对科研兴趣较大。曾获得专业二等奖学金。 项目组同学都有一定的动手实践能力，项目组指导老师耐心专注，有较好的学术修养，项目一定能获得佳绩，圆满成功。 七、经费预算 1.试验材料费：1000元 2.室内分析药品费：1500元 3.材料复印论文写作费：500元 合计：3000元 八、指导教师意见 签字： 20 年 月 日 九、评审小组意见 建议资助金额 小组负责人（签字）： 小组成员（签字）： 十、申请人所在学院意见 确定资助金额 元 学院公章 学院负责人（签字）： 20 年 月 日 十一、主管部门审核意见 单位（教务处代）公章 负责人（签字）： 20 年 月 日 元