交叉引物恒温扩增技术在结核分枝杆菌检测中的应用

交叉引物恒温扩增技术在结核分枝杆菌检测中的应用

毛秀军1，李世明1，葛晓励2，张国强3，孙绍秋3，王惠良4

【摘 要】【摘要】目的 探讨交叉引物扩增技术(CPA)快速检测系统在结核病诊断中的价值。方法 收集唐山市第四医院2015年3～5月206例结核病就诊患者的痰液标本，其中肺结核患者95例(其中痰涂片阳性26例，阴性69例)，非结核患者111例，分别采用RT-PCR法实时荧光定量聚合酶链反应法(RT-PCR)检测标本中的结核分枝杆菌，对结果进行统计分析。结果 涂片法、罗氏培养法、EasyNAT? TB-CPA 法检测初诊疑似肺结核患者痰液的灵敏度分别为：27.37%(26/95)、50.53%(48/95)、56.84%(54/95)、51.58%(49/95)。以罗氏培养结果为诊断金标准，EasyNAT? TB-CPA 法灵敏度为89.58%(43/48)，特异度94.94%(150/158)；RT-PCR法的灵敏度为83.33%(40/48)，特异度94.30%(149/158)；EasyNAT? TB-CPA与RT-PCR法相比，总体一致性为98.54%(203/206)，Kappa指数值为0.92。结论 TB-CPA法在检测痰液标本中具有较高的临床应用价值，且方法简便、快速。 【期刊名称】检验医学与临床 【年(卷),期】2016(013)008 【总页数】3

【关键词】【关键词】结核分枝杆菌； 恒温扩增； 培养法； 交叉引物扩增技术

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，是全球最具威胁的传染病之一。据世界卫生组织统计，我国患结核病人数居世界第2位，是全世界22个结核病流行严重的国家之一[1]。结核病实验室检查是结核病诊断、治疗方案制

定和治疗效果评估的重要依据。目前我国大多数实验室广泛采用细菌学检查方法，包括抗酸杆菌痰涂片镜检和分枝杆菌分离培养[2]。涂片检查简便、易行，但阳性检查率较低[3-4]；分离培养法是目前结核病诊断的金标准，具有很高的灵敏度，但至少需要3～8周的时间，但耗时较长，不能满足结核病早期诊断的要求。随着分子生物学的发展，近年来涌现出很多方法用于结核分枝杆菌的快速诊断及鉴定[2]。然而，以基因序列为基础的快速诊断方法虽然快速、敏感，但仪器、设备和试剂比较昂贵。交叉引物扩增技术(CPA)是一种新的核酸恒温扩增技术，也是中国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术[5-6]。CPA是将核酸扩增反应的全过程均在同一温度(63±2)℃下进行，不需要像实时荧光定量聚合酶链反应法(RT-PCR)那样经历几十个温度变化的循环过程。CPA方法简单，设备要求低，可通过一次性肉眼判读结果，且保持了核酸扩增快速、高灵敏度的特点，适合在基层医院推广使用。本研究将CPA法与传统痰涂片镜检法、罗氏培养法和RT-PCR法痰标本中结核分枝杆菌的检测进行临床应用评价，以期满足临床诊断的需求。

1 资料与方法

1.1 一般资料 连续收集唐山市第四医院结核病专科门诊2015年3～5月初诊疑似者肺结核患者痰标本。纳入标准：(1)咳嗽咳痰超过2周因呼吸道症状接受检查的初诊可疑结核病患者；(2)同意留取合格的痰标本并进行检测；(3)痰标本量≥2 mL。就诊患者依照肺结核临床诊断流程参考文献[7]。排除标准：(1)随访的结核病患者；(2)不签署知情同意的结核病患者；(3)已经使用抗结核药物治疗大约2周的患者；(4)试验过程中，因技术性因素造成结果缺失者。最终纳入206例患者，年龄16～70岁，平均(35.0±15.6)岁，男86例，女40例。经

临床诊断的结核病患者182例，其他肺部疾病患者24例。

1.2 仪器与试剂 萋-尼染色试剂(抗酸染色液)由本实验室自己配置；罗氏培养基为外购杭州加伟生物技术有限公司；RT-PCR试剂外购自A厂家(生产批号20150112)；结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(恒温扩增试纸条法)由杭州优思达生物技术有限公司生产(批号20150116)；MK-10E干式恒温金属浴为杭州奥盛仪器有限公司生产；PRC仪器为ABI7500荧光PCR仪。EasyNAT? 核酸提取试剂(注射器法)由杭州优思达生物技术有限公司生产(批号20150124)。 1.3 方法

1.3.1 痰涂片和培养 将收集的痰标本进行荧光法涂片镜检，痰标本的收集和涂片镜检按照《痰涂片镜检质量保证手册》进行操作。荧光染色后镜检，剩余标本依照痰液黏稠程度加入2～3倍4% NaOH，每次均设置空白对照[8]。37 ℃温箱培养，每周观察并及时记录结果。培养阳性的菌株采用硝基苯甲酸(PNB)培养基法进行分枝杆菌鉴定。

1.3.2 EasyNAT? TB-CPA法检测 分别检测国家结核病参比实验室提供的结核核酸参考品(S1～S4)，结核分枝杆菌浓度(/mL)分别为103、102、10、1[9]。采用杭州优思达生物技术有限公司生产的EasyNAT?核酸提取试剂(注射器法)对结核分枝杆菌进行DNA的提取；按照EasyNAT? TB-CPA操作说明进行操作，15 min后读取结果并记录试验结果[10]。结果判读：若检测T线和质控C线同时出现或检测T线显色时，判读为阳性；若只有质控C线出现时，判定为阴性；若质控线，检测T线都未出现时，结果为无效。查找原因，可能是扩增抑制，导致失败；或试剂盒损坏导致失败。

1.3.3 RT-PCR法检测 按照厂家试剂说明书操作，使用ABI7500进行扩增和