怀头鲇胃黏膜蛋白酶分离提纯条件的筛选
刘伟1，曾真2，战培荣1
【摘 要】摘要:采用两种硫酸铵饱和梯度盐析方法对怀头鲇Silurus soldatovi胃黏膜蛋白酶激活液进行粗提，用6种组合层析条件对胃蛋白酶粗提液进行Sephadex G-75凝胶过滤层析，获得初步纯化的蛋白酶，并通过蛋白质浓度、蛋白酶活力及SDS-PAGE凝胶电泳对其分析鉴定。结果表明:在28%、56%、83%(NH4)2SO4饱和度条件下分级盐析效果比较理想;不同层析条件下层析峰分离液的蛋白酶活力测定均显示出酶活性，层析峰蛋白酶比活力较粗提液提高5～9倍，60 cm柱 (层析柱高52 cm、直径1.6 cm)层析峰分离效果较好。从盐析粗提液电泳结果，以及在60 cm层析柱、pH为3.3的0.01 mol/L β-丙氨酸-甲酸缓冲液、0.8 mL/min流速条件下的层析峰蛋白分管收集液酶活力峰值和层析峰峰顶形状判断，怀头鲇胃蛋白酶可能有两种蛋白组分存在，并测得相对分子质量为26 000～47 000。 【期刊名称】大连海洋大学学报 【年(卷),期】2012(027)006 【总页数】6
【关键词】关键词:怀头鲇;胃蛋白酶;盐析;凝胶过滤层析
怀头鲇Silurus soldatovi隶属于鲇科Siluridae、鲇属Silurus，是黑龙江流域特产的大型肉食性鱼类，目前已被列入易濒危鱼类。怀头鲇栖息于较宽敞水体中，营底栖生活，多夜间捕食，冬季亦有摄食;自然水域中，主要捕食鱼类，亦食水生昆虫、蛙、鼠等活动物及其尸体，能吞食相当于自身长度2/3的鱼类;其胃容量大，消化能力极强，生长快。怀头鲇具有很高的营养价值［1-2］，其胃
还具有消肿补气等药用价值［3］。因此，探讨其酶性质与消化机能有重要意义。 有关鱼类消化酶的研究主要集中在鱼类食性、饲料、季节变化与消化酶的关系，酶促反应与酶动力学，胚后发育阶段消化酶的发生与演变，消化酶在体内消化组织的分布等［4-9］。对太湖沿岸地区几种常见肉食性鱼类的胃蛋白酶和胰蛋白酶活性进行比较研究表明，肉食性鱼类 (特别是胃发达的)食物的消化主要在胃中，胃蛋白酶活性明显高于肠蛋白酶［10］。怀头鲇在摄食后3 h胃蛋白酶活性达到高峰，比肠蛋白酶活性高近1倍，并持续2～3 h［11］。Diaz等［12］用 SDS-PAGE 凝胶电泳研究了鲷科鱼类幼体消化道中出现的蛋白酶类。而有关鱼类消化酶的分离提纯及应用研究较少。
蛋白酶的分离提纯研究始于20世纪50年代，对几种常见的酶类如胃蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶等研究发现，各物种同源蛋白酶间存在不同程度的差异。1979年Becker等［13］用DEAE离子交换层析和亲和层析先后提纯了人胃蛋白酶Ⅰ、Ⅱ，并对其性质作了研究。中国学者相继用DEAF-52阴离子交换层析、高压液相凝胶过滤层析从人胃黏膜中分离纯化到相对分子质量为67 000的胃蛋白酶原［14-15］;用底物亲和法分离纯化了蕲蛇胃蛋白酶［16］;用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Phenythl-Sepharose疏水层析纯化了嗜热真菌热稳定蛋白酶［17］。近年来研究者以提高鱼类消化酶的利用，或增加水产副产品为目的，对鱼类蛋白酶研究逐步深入。张继平等［18］提取了暗纹东方鲀的胃蛋白酶，黄丽洋等［19］提取了斑点叉尾鮰的肠蛋白酶，Ulitina等［20］从欧洲鲇Silirus glanis L.胃黏膜中分离出3种蛋白酶 (P1、P2和P3)。而对欧洲鲇的地理相近种——怀头鲇胃蛋白酶的分离纯化目前国内外尚未见报道。本研究中，作者采用硫酸铵饱和梯度盐析和Sephadex G-75
凝胶过滤层析技术，初步建立了分离纯化怀头鲇胃黏膜蛋白酶的方法，旨在为进一步探讨怀头鲇消化生理机能与食性的关系，以及鱼类胃蛋白酶的应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验用怀头鲇取自黑龙江水产研究所名优鱼类繁殖基地同批人工孵化鱼苗，饲养于室内控温水族箱 (80 cm×60 cm×50 cm)，仔稚鱼阶段投喂水蚤、水蚯蚓等活饵料，幼鱼至2龄阶段投喂冰冻海泥鳅Plotosus liaeatus Thunberg，试验时平均体质量约800 g。水族箱设有水循环过滤装置，以充分曝气的地下水为水源，水温为20～22℃。 1.2 方法
1.2.1 胃蛋白酶的粗提 (粗分级)
1)采样时间。怀头鲇胃黏膜蛋白酶活性在摄食后3 h达到高峰，故在喂食后3～4 h进行采样［5］。
2)酶原抽提。在冰盘上解剖怀头鲇并剪下整个胃部，用蒸馏水清洗，再剪去胃外壁肌肉，保留内壁黏膜组织。将黏膜组织剪碎，加入4倍质量的双蒸水，用高速匀浆器以10 000～13 000 r/min低温匀浆2 h(每5 min间歇匀浆1 min)。若匀浆中有较多组织碎块，应尽可能剪碎黏膜组织。再将匀浆液以8 000 r/min冷冻离心15 min，上清即为胃蛋白酶原抽提液，蛋白酶活力为0.516 IU/mg。
3)酶原激活。用1 mol/L的盐酸将胃蛋白酶原抽提液pH调至2.8，静置2 h，酶原被激活为有活性的蛋白酶，即胃蛋白酶激活液，蛋白酶活力为61.95
怀头鲇胃黏膜蛋白酶分离提纯条件的筛选
