吉西他滨抑制胰腺癌细胞糖酵解
由 磊，任晓霞，崔 铭，马 琳，赵玉沛*
【摘 要】摘要：目的研究吉西他滨对miR- 1208在胰腺癌细胞中表达的影响及其抑制胰腺癌细胞糖酵解的分子机制。方法用real-time PCR法检测胰腺癌组织及细胞系中miR- 1208以及糖酵解关键基因的表达；在胰腺癌细胞系BxPC- 3与PANC- 1分别转染miR- 1208模拟物与阴性对照，利用CCK- 8试剂盒、乳酸以及葡萄糖检测试剂盒，研究细胞增殖、乳酸分泌以及葡萄糖利用情况；设计拯救实验研究吉西他滨、miR- 1208与胰腺癌细胞代谢的关系。结果miR- 1208在胰腺癌组织中表达下调(60%，12/20)(P<0.05)；miR- 1208过表达明显抑制胰腺癌细胞增殖、乳酸分泌以及葡萄糖的消耗(P<0.05)，miR- 1208导致LDH-A与LDH-D的内源性表达水平下调；经吉西他滨处理的胰腺癌细胞系BxPC- 3与PANC- 1，其内源性miR- 1208表达水平明显上调(P<0.01)，而其LDH-A、LDH-D的表达水平明显下调(P<0.01)。在胰腺癌细胞中，敲低miR- 1208表达抑制吉西他滨诱导的细胞代谢方式转换。LDH-A是miR- 1208在胰腺癌细胞中的功能靶基因。结论吉西他滨通过调控miR- 1208介导的LDH-A通路发挥抑制胰腺癌细胞糖酵解的功能。 【期刊名称】基础医学与临床 【年(卷),期】2016(036)006 【总页数】6
【关键词】miR- 1208;胰腺癌;吉西他滨化疗 【
文
献
来
源
】
https://www.zhangqiaokeyan.com/academic-journal-cn_basic-clinical-
medicine_thesis/0201222646636.html
浆细胞瘤变异移位子1(plasmacytoma variant translocation 1, PVT1)是由pvt1基因(亦称为Pvt1原癌基因)编码的长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，在1984年，作为MYC的激活因子在鼠浆细胞瘤变异移位中被首次报道[1- 2]。近年来的研究显示，PVT1不仅在多种肿瘤中表达上调，发挥癌基因的作用[3]，而且与肿瘤临床治疗效果存在密切关系，如PVT1 lncRNA的稳定性与吉西他滨化疗敏感性存在密切的相关性[4]。PVT1可以编码多个microRNA，即miR- 1204- 1208家族，相关加工过程的调控在一定程度上增加了PVT1功能的复杂性。miR- 1208作为该miRNA家族的成员，其表达水平受到吉西他滨的影响。本研究旨在阐述miR- 1208在胰腺癌细胞代谢中的功能，并揭示吉西他滨通过诱导miR- 1208表达上调，抑制胰腺癌细胞的糖酵解途径的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料
20例胰腺癌组织(北京协和医院基本外科收集，男16例，女4例，平均年龄51岁，所有患者均经过医学伦理学认证并签署知情同意书)。胰腺癌细胞系Su.86.86、AsPC-1、PANC-1、PCT-3、MIA Pa2Ca2、Capan- 1、BxPC- 3与SW1990(本实验室保存)，DMEM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，Trizol试剂(Invitrogen公司)，miR- 1208表达分析试剂盒(Taqman公司)，miR- 1208模拟物、抑制剂及相应阴性对照品(Dharmcon公司)，转染试剂Effectene(Qiagen公司)，CCK- 8细胞增殖分析试剂盒(同仁化学研究所)，乳酸检测试剂盒(BioVision公司)与葡萄糖检测试剂盒(Sigma公司)，LDH-A与α-tublin抗体(Abcam公司)，其他所用试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取、Real-time PCR分析：RNA提取按照Trizol说明书进行；反转录及miR- 1208 Real-time PCR按照Taqman公司操作说明进行。
1.2.2 细胞转染与Western blot分析：细胞转染miR- 1208类似物或抑制物按照Effectene转染试剂的操作说明进行。转染后收集细胞并裂解,用BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，电转移至PVDF膜，以5%脱脂奶粉封闭2 h，依次孵育一抗、二抗，洗膜后用显色剂ECL试剂显色并压X线片，曝光显影后，扫描采集图像。
1.2.3 细胞培养：用DMEM完全培养基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素)，在5% CO2、饱和湿度、37 ℃ 培养箱内常规传代培养胰腺癌细胞。收集对数增殖期的细胞进行实验，各项实验至少重复3次。 1.2.4 CCK- 8检测细胞增殖：将增殖状态良好的PANC- 1与BxPC- 3细胞接种于96孔板，转染时细胞达到30%～50%每孔。分别在转染后12、24、36、48和60 h，取出培养板，每孔加CCK- 8 10 μL(5 g/L)，置37 ℃，5% CO2孵箱继续培养1～4 h。用酶标仪测波长为450 nm的各吸光度值(A450值)。每组设3个复孔，取均值绘制细胞增殖曲线。
1.2.5 乳酸分泌与葡萄糖利用检测：在转染miR- 1208或阴性对照的胰腺癌细胞中分别取培养上清，利用Lactate Colorimetric Assay Kit Ⅱ检测细胞培养基中的乳酸含量，操作按照实际盒提供的操作说明进行；葡萄糖检测利用Glucose(GO)Assay Kit提供的操作说明进行分析。
1.2.6 拯救实验(rescue assay)：在胰腺癌细胞中转染miR- 1208抑制剂(anti- 1208)，同时用吉西他滨处理细胞48 h，利用anti- 1208降低吉西他滨的诱导
吉西他滨抑制胰腺癌细胞糖酵解
