《出口活鱼中泰妙菌素检验规程》编制说明
一、项目概况
依据国家认监委《关于下达2010年出入境检验检疫行业标准制(修)订计划项目的通知》（国认科函〔2010〕88号）文件要求，由徐州出入境检验检疫局承担《出口活鱼泰妙菌素检测技术规范》标准的制定工作，任务编号2010B019。 二、编制依据
本标准是按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写的规则》、GB/T 20001.4-2001《标准编写规则 第4部分：化学分析方法》和行业标准SN/T0001-1995《出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》的要求编写的。 三、研究的背景
泰妙菌素( Tiamulin)又名泰妙灵和支原净, 是由高等真菌担子菌侧耳属 Pleurotus mutilus和Pleuros passeckerianuus菌种的深层培养液提取的截短侧耳素 ( Pleuromutilin) 的氢化延胡索酸盐, 是双萜烯化合物半合成的抗生素。由于泰妙菌素对支原体最具活性, 是治疗畜禽支原体疾病的首选药物, 对黄色葡萄球菌、链球菌等有很强的抗菌活性, 并对部分弯曲杆菌、螺旋体、真菌、球虫等有很强的制作用, 因此作为兽药和饲料添加剂而被广泛应用，尤其是对猪痢疾、猪腹泻及霉形体肺炎具有优异的治疗及预防效果，因此作为兽药和饲料添加剂而被广泛应用。但泰妙菌素残留可能对人类健康造成严重潜在危害, 如可能带来大肠杆菌菌群失调和结肠炎的危险, 与莫能菌素、盐霉素等聚醚类抗生素合应用时, 可导致中毒, 甚至死亡。因此，世界各国针对动物组织及相关产品中的泰妙菌素残留量作出了严格的限定。我国农业部规定了泰妙菌素的ADI(日许量)为0~30μg/kg.b.w/d，在猪体内组织的最高残留限量(MRLs)：肌肉100μg/kg，肝500μg/kg，由于肾脏、脂肪和皮肤中残留浓度低，所以没有制定其最大残留限量标准。日本农林渔业部对动物肝脏、脂肪、肌肉组织中泰妙菌素的最高残留限量为0.04-6 mg/kg。2010年3月26日，韩国农林水产食品部调整发布了2010年进口水产品检验检疫项目，对进口水产品新增检测泰妙菌素、吡喹酮、组胺等项目及品种15个。我国活鱼出口市场主要集中在日本、韩国等东南亚国家。因此为了有效控制泰妙菌素的安全使用，保障产品的食用安全及打破国外技术壁垒，保障产品
的顺利出口，有必要建立动物源性食品中泰妙菌素残留量的检测标准及方法。
目前有关泰妙菌素检测技术主要有气相色谱法 (GC) 、高效液相色谱法(HPLC)和高效液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)法。GC法需要衍生化，操作复杂；液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)准确度和灵敏度高，为各种兽药残留的确证方法，但设备昂贵、操作要求高、一般基层单位不具备。因此本方法参照采用国内外有关文献为基础，经研究、优化和验证后制定，采用高效液相色谱对鱼肉中泰妙菌素的残留量进行检测，考察了前处理条件和仪器测定参数，旨在建立一种高效、快捷的方法来同时检测满足出口活鱼检测的要求。 四、方法概述
本标准选择了具有代表性的出口鲫鱼、鲈鱼、鮰鱼等活鱼进行研究，经过净化方法优化，液相色谱测定条件试验，选择用PBS缓冲液和乙酸乙酯混合提取，,提取物加石油醚除脂，用HLB柱SPE小柱净化, 经C18色谱柱分离，通过淋洗去除柱上杂质，将目标物分离下来，氮吹后定容。高效液相色谱测定，外标法定量，适用于活鱼中可食组织中残留量的检测。本方法经回收率试验，精密度试验，方法验证试验。结果表明，各项技术指标均完全满足检测需要。 五、实验方法论证情况 5.1 提取和净化条件
根据文献报道，根据泰妙菌素的理化性质，加入pH8.0的磷酸盐缓冲液将延胡索酸泰妙菌素转换成分子态，再选择有机溶剂将目标物提取出来。分别使用乙酸乙酯和丙酮作为提取液，比较提取效果，结果表明，乙酸乙酯的提取效果较好，提取杂质少，可有效的避免了基质干扰。 采用石油醚能去除样品溶液中的脂肪等杂质，初步净化效果较好。根据延胡索酸泰妙菌素有大分子的官能团，通过 Oasis HLB柱进行样品净化和富集 ,可取得良好的净化效果。
在优化提取条件时，采用向鱼肉中添加浓度为0.5 mg/kg 的泰妙菌素，分别用上述方法分一次、两次和三次提取，回收率依次为76.8%、90.5% 和92.7%，因此选择分两次提取，提取液分别为30mL、20mL。
5.2液相色谱分析条件的确定 5.2.1 色谱柱选择
选择常用的岛津ODS-3型C18（250 mm×4.6 mm，5μm）柱、Agilent zorbax XDB C18（250 mm×4.6 mm，5μm）柱，均可以使待测物组分在较短的时间内实现最大程度的有效分离。 5.2.2 检测波长的确定
标准品通过DAD检测器三维图谱扫描，可看到，延胡索酸泰妙菌素在210nm处有最大吸收，因此选择210nm作为检测波长。 5.2.3流动相的选择
根据参考文献，流动相有甲醇-乙腈-碳酸铵、甲醇-庚烷磺酸钠离子对试剂法、甲醇-乙腈-磷酸二氢钾等。对以上条件进行了筛选，结果表明，离子对试剂及含盐的流动相基线平衡时间较长，基线不稳且响应值一般，对柱子损伤较大。使用乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水体系，峰形均较好，不仅能将待测物很好地分离出来，不受杂峰的干扰，但乙腈：0.1%磷酸体系出峰时间较早，而甲醇：0.1%磷酸水（v:v=10:90）出峰时间较适中，峰宽、峰形等定量条件较好，无拖尾，以此作为流动相条件。 5.2.4 定量方式
采用外标法定量，以校准溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对待测样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。 保留时间为7.2min。
图1 标准溶液HPLC色谱图
5.3.5线性范围及定量限
在上述色谱条件下，对0.2、0.5、0.8、1.5、2.0mg/L的泰妙菌素标准工作液进行分析。结果表明，在此浓度范围内，泰妙菌素色谱峰面积与浓度呈线性相关，其线性回归方程为：Y=7.0727X-0.2253，r=0.9989 ，符合定量要求。
泰妙菌素添加0.1mg/kg时，其信噪比均大于10，获得较好的回收率及精密度，由此确定本标准泰妙菌素的检测低限为0.05mg/kg。
表1 延胡索酸泰妙菌素标准曲线
y = 7.0727x - 0.2253R2 = 0.9989area161412108642000.511.52C(mg/L)
5.3.6方法的回收率和精密度
用阴性鱼肉样品做添加回收和精密度实验，考察方法的准确度和重现性。样品添加不同浓度标准后，按本方法进行提取、净化和测定，每个水平添加5个样品，测定3个批次。泰妙菌素添加量均为0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg水平的标准溶液，其平均回收率及相对标准偏差见表1。从表中看出，三个添加水平回收率在73.8%~103.1 %之间，批内相对标准偏差在4.7%~8.5%之间，方法的回收率和精密度良好。
图3 空白鲫鱼样品色谱图
图4 鲫鱼加标样品色谱图
出口活鱼中泰妙菌素检验规程编制说明
