International Journal of Ecology 世界生态学, 2020, 9(2), 151-158
Published Online May 2020 in Hans. http://www.hanspub.org/journal/ije https://doi.org/10.12677/ije.2020.92019
Relative Expression of Integrin β1
in Cyprinid Herpesvirus 3 (CyHV-3) Virus
Jiaxin Sun1,2, Zhiying Jia1,2*, Xiaona Jiang2
1
National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University; Shanghai Collaborative Innovation for Aquatic Animal Genetics and Breeding, Shanghai 2
Heilongjiang River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Harbin Heilongjiang
Received: Mar. 24, 2020; accepted: Apr. 9, 2020; published: Apr. 16, 2020
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Abstract
Integrins are the cell adhesion factors that promote intercellular and extracellular matrix (ECM) interactions, including the alpha and beta subunits. Integrin β1, binding to the alpha subunits, is widely expressed in vivo. In this study, the spleen and kidney tissues of common carp infected with CyHV-3 virus were used as experimental materials. The integrin β1 was used as the target gene by real-time quantitative PCR technology to analyze the expression of integrin β1 in different stages of carp CyHV-3 virus. The results showed that in the early stage of CyHV-3 infection, the expression of integrin β1 in the head and kidney increased significantly, and gradually decreased with the extension of the infection time, but its effect in the carp needs further study.
Keywords
Integrin β1, Common Carp, Expression, CyHV-3
整合素β1在鲤CyHV-3病毒中基因相对表达量研究
孙佳鑫1,2，贾智英1,2*，姜晓娜2
12
*
上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心；水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心，上海 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨
收稿日期：2020年3月24日；录用日期：2020年4月9日；发布日期：2020年4月16日
通讯作者。
文章引用: 孙佳鑫, 贾智英, 姜晓娜. 整合素β1在鲤CyHV-3病毒中基因相对表达量研究[J]. 世界生态学, 2020, 9(2): 151-158. DOI: 10.12677/ije.2020.92019
孙佳鑫 等
摘 要
整合素是促进细胞间和细胞外基质(ECM)相互作用的细胞粘附因子，包括α和β亚单位。整合素与α亚单位结合，在体内广泛表达。本研究以感染鲤CyHV-3病毒的鲤鱼的脾、肾组织为实验材料，利用实时荧光定量PCR技术以整合素β1作为目的基因，分析整合素β1在鲤CyHV-3病毒不同阶段中的表达量，结果显示，在CyHV-3感染早期，头肾整合素β1的表达显著增加，并随着感染时间的延长而逐渐减少，但对其在鲤鱼体内的作用尚需进一步研究。
关键词
整合素β1，鲤鱼，表达，CyHV-3
Copyright ? 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Open Access 1. 引言
整合素是细胞与细胞间和细胞外基质粘附的介质，同时也是基质分子受体，通过信号途径接收细胞外分子信号和转导，影响细胞增殖，调节细胞周期和细胞迁移过程[1] [2] [3] [4]。整合素的异常表达和功能与心血管疾病、血液疾病、炎症疾病和癌症等病理疾病的病因密切相关[5]。整合素属于跨膜受体家族，是由α和β亚单位组成的异二聚体(Campbell和Humphries，2011)。整合素家族有14种α亚基和8种β亚基，α亚基主要调节整合素与阳离子依赖性配体的结合[6]。整合素β亚基参与细胞骨架蛋白与细胞内信号转导的相互作用，调节细胞的生物学功能，其中整合素β1亚基作用最为广泛。整合素β1至少形成18个具有不同α亚基的异二聚体，主要包括α1-11β1和αVβ1 [7]。
整合素β1分布于平滑肌、成纤维细胞和肿瘤细胞等多种细胞中，整合素β1的配体主要是细胞外基质与细胞间的粘附分子[8] [9]，先前在小鼠身上的发现表明，整合素β1对血管稳定性和内皮细胞内VE-cadherin定位是必要的，β1亚单位可以与12种不同的α链结合，在细胞基质粘附中起着中心作用[10]。最近也有报道称，斑马鱼心血管形成需要整合素β1的活性[11]，整合素β1激活的信号反应主要包括局灶粘附途径(FAK)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径、PI3K途径[12]。整合素β1-FAK-Ras-MAPK信号通路是整合素β1介导的重要信号转导通路，是许多疾病发生发展的重要机制和潜在的疾病治疗靶点，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种细胞生物学反应、迁移和恶性退化[13] [14] [15] [16]。
鲤鱼是世界上最重要的淡水鱼之一，属于鲤鱼目，是一种杂食性底鱼，食性广，生长快。鲤鱼的各种适应性生理机制赋予了鲤鱼在这些多样的振荡环境中生存的能力。天然免疫系统是鲤鱼抵御病毒感染的第一道防线[17]。鲤疱疹病毒(CyHV-3)是高度传染性锦鲤疱疹病毒病的病原，最早上世纪发现于德国以来，陆续在澳洲、英国、美国、日本、南非、欧洲大陆等国家以及地区流行性爆发，持续流行感染，给鲤(Cyprinus carpio)及锦鲤养殖业造成了无法估量的经济损失。整合素β1在脊椎动物天然免疫中起着重要的分子桥梁作用。因此，鉴定和分析鲤鱼整合素β1的遗传信息，对进一步了解鲤鱼的抗病机理具有重要意义。本研究运用荧光定量技术，以整合素β1基因为目的基因，对感染鲤疱疹病毒(CyHV-3)病的鲤鱼内脏组织进行了生物信息学分析，为进一步研究鲤鱼整合素β1的分子机制提供了数据支持。
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2. 材料和方法
2.1. 实验设计
实验鱼均来自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所宽甸渔业试验站，分为感染组(患病鲤鱼)和对照组(健康鲤鱼)，所用实验鱼体长10~15 cm，体重为72.13 g ± 10.3，在大小为1.6 m × 1.2 m × 0.6 m的水箱中各投放300条鱼，水温保持在25℃，并每天以3%体重喂食。待实验鱼进入水箱稳定24 h之后，攻毒实验按照Adamek等[18]的方法，将携带病毒个体的内脏组织，进行液氮研磨后投放至实验鱼中，从而进行攻毒感染实验。每48小时采集一次选育组与未选育组的脾、肾组织，利用鲤鱼整合素β1基因，通过实时荧光定量PCR技术明确其在鲤CyHV-3病毒中脾、肾组织基因相对表达量情况，进一步研究鲤鱼整合素β1基因的功能。
2.2. 实验鱼及样品采集
分别采集感染组和对照组当中实验鱼的脾、肾组织，各采集3尾。且每组设两组平行。所有采集样本的内脏组织均立即储存在RNAlater当中，在4℃温度下12小时之后储存在?20℃温度，之后转移至实验室?80℃超低温冰箱中保存备用。采集样本进行RNA提取和蛋白质提取。
2.3. 主要试剂及仪器
组织DNA试剂盒(MagPure Tissue DNA KF Kit)
2×Es Tag Master Mix (康为世纪生物公司，产品号CW0690) QIAGEN RNA提取试剂盒(RNeasy lipid tissue mini kit) 逆转录试剂盒康为世纪(super Quick RT CDNA Kit)
SYBR Green I荧光染料试剂盒(康为世纪UItra SYBR Mixture (high ROX)) 美国BIO-RAD PCR仪C1000 Nanovue微量分光光度仪 Agilent Mx3005P荧光定量PCR仪
2.4. 脾、肾组织总RNA提取及质量检测
使用QIAGEN RNA提取试剂盒(RNeasy lipid tissue mini kit)提取鲤鱼脾、肾组织总RNA。Nanovue微量分光光度仪测定RNA浓度。2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，?80℃保存RNA。将RNA逆转录为cDNA (康为世纪super Quick RT CDNA Kit)，2%琼脂糖凝胶电泳检测cDNA并测cDNA浓度，并根据荧光定量试剂盒说明书要求稀释cDNA至5~10 ng/μL左右，?20℃保存备用。
2.5. 实时荧光定量PCR
设为选育组与未选育组，以18sRNA作为内参基因，以整合素β1基因作为目的基因，利用实时荧光定量PCR比较整合素β1在鲤CyHV-3病毒体内感染中的基因相对表达量情况。
所有引物均由生工生物上海有限公司提供，引物信息见表1，实时荧光定量PCR反应体系为25 μL，2×UItra SYBR Mixture (highROX) 12.5 μL，上游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，基因组 RNA 1 μL/cDNA 0.5 μL，ddH20补足25 μL。上机程序：1) 循环数 1，UNG 酶启动，50℃ 10 min；2) 循环数 1，预变性，95℃ 1 min；3) 循环数 40，变性：95℃ 30 s，退火：X℃ 1 min；4) 溶解曲线：95℃ 1 min，55℃ 30 s，95℃ 1 min。所有样本均进行了三次重复，每个样品的Ct值为三次重复的均值，病毒载量研究中以去离子水为空白对照，去除假阳性可能。
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Table 1. Primers used in quantitative real-time PCR 表1. 荧光定量PCR引物
引物名 Primers Integrin β1 18S RNA
引物序列(5'-3') Sequences (5'-3') F:GCMAACTCCAGCAA R:ACGGGCRCTCTTGTAA F:TCTGCCCTAACTTTCGATGGTA R:AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCTTT
退火/℃ Tm 60 60
2.6. 数据统计与分析
使用2-ΔΔCt法[19]处理荧光定量实验数据计算出相对表达量。所有实验均在三个生物重复试验中进行。采用SAS 9.1中的Bonferroni t检验，用两组比较的方法评价两组间的显著性。数据显示为三个重复的平均值±标准差。在p < 0.05时(*p < 0.05表示差异显著；**p < 0.01和**p < 0.001表示差异极显著)具有统计学意义。
3. 结果与分析
3.1. 不同感染时期整合素β1基因相对表达量情况
在人工攻毒感染实验采集的样品中，脾、肾组织中均检测到了整合素β1基因的存在。
在脾、肾组织中，选育组与未选育组基因相对表达量均在48~288 h这6个时期当中呈现下降趋势，且在48 h达到最高表达量。其中，脾组织的选育组组与未选育组在48~288 h这6个时期之间并无明显差异(P > 0.05) (如图1(a)，图1(b))。
在肾组织中，选育组在96 h与144 h相比基因的表达量差异极显著(p < 0.001)，在144~288 h之后表达量趋于平缓且无明显差异(P > 0.05) (如图1(c)。未选育组在48 h与96 h相比基因的表达量呈现显著差异(p < 0.05)，在96~288 h之后表达量趋于平缓且无明显差异(P > 0.05) (如图1(d))。
3.2. 脾、肾组织中整合素β1基因相对表达量情况
将脾组织及其对照组、肾组织及其对照组的基因表达量进行对比。
在选育组中，脾组织基因的表达量在48~96 h高于其对照组组织，其中48 h脾组织的表达量显著高于其对照组(P < 0.05)，在144~288 h脾对照组基因的表达量高于脾组织，其中240 h、288 h (P < 0.001, P < 0.01)呈现极显著差异(如图2(a))；肾组织基因的表达量在48~96 h高于其对照组组织，其中48 h时脾组织的表达量显著高于其对照组(P < 0.05)；肾对照组基因的表达量在144~288 h高于脾组织，其中144 h、192 h、240 h、288 h (P < 0.01, P < 0.001, P < 0.05, P < 0.001)均呈现显著性差异(如图2(b))。
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注：标记*不同表示组内存在显著性差异(*P < 0.05, **P < 0.01,***P < 0.001)
Figure 1. Relative expression of integrin b1 in spleen and kidney tissue at different infection stages. (a) Expression of spleen tissue in the selective group; (b) Expression of spleen tissue in the non-selected group; (c) Expression of kidney tissue in the selective group; (d) Expression of kidney tissue in the non-selected group
图1. 不同感染阶段脾、肾组织中整合素β1基因相对表达量情况。(a) 选育组脾组织表达情况；(b) 未选育组脾组织表达情况；(c) 选育组肾组织表达情况；(d) 未选育组肾组织表达情况
注：标记*不同表示组内存在显著性差异(*P < 0.05, ** P < 0.01, ***P < 0.001)
Figure 2. Comparison of relative expression of integrin b1 in spleen and kidney tissue at different infection stages. (a) Ex-pression of spleen tissue and its control group in selection group; (b) Expression of kidney tissue and its control group in se-lection group; (c) Expression of spleen tissue and its control group in unselected group; (d) Expression of kidney tissue and its control group in unselected group
图2. 对比不同感染阶段脾、肾组织中整合素β1基因相对表达情况。(a) 选育组脾组织及其对照组表达情况；(b) 选育组肾组织及其对照组表达情况；(c) 未选育组脾组织及其对照组表达情况；(d) 未选育组肾组织及其对照组表达情况
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