南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2018，49（10）：1909-191610期2095-1191；ISSNCODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com·1909·DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2018.10.02茉莉花磷酸甲羟戊酸激酶基因克隆及表达分析
陈笛，王鹏杰，郑玉成，郑知临，陈桂信*，叶乃兴*
（福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室，福州
350002）
摘要：【目的】克隆茉莉花磷酸甲羟戊酸激酶（PMK）基因（JsPMK），对其进行生物信息学分析并检测其表达时间节律性，为深入研究茉莉花萜类化合物生物合成途径及其调控机制提供理论参考。【方法】以茉莉花花瓣为材料，采用RT-PCR扩增JsPMK基因全长，利用生物信息学软件对其编码蛋白进行预测分析，并采用qRT-PCR检测JsPMK基因在茉莉花开放过程中的表达情况。【结果】克隆获得的JsPMK基因（GenBank登录号为MH311042）全长1951bp，包含1518bp完整的开放阅读框（ORF），共编码505个氨基酸，其编码蛋白定位于细胞质，为稳定的非分泌蛋白。JsPMK蛋白含有GHMP激酶N端保守区和C端保守区，且在N端保守区含一个ATP结合位点Gly-X-Gly-XX-Ala。JsPMK蛋白与野生油橄榄、芝麻、丹参和番茄的PMK蛋白氨基酸序列相似性均较高（在80%以上），其中与野生油橄榄亲缘性最近，表明不同植物PMK蛋白高度保守。JsPMK基因在未开放（18∶00）时表达量最低，随着茉莉花逐渐开放，JsPMK基因表达量极显著上升（P<0.01，下同），在20∶00达最大值，随后表达量极显著下降。【结论】JsPMK基因表达可能受生物钟调控，在茉莉花萜类化合物合成和香气释放中发挥重要的调控作用。
关键词：茉莉花；磷酸甲羟戊酸激酶（PMK）；基因克隆；表达分析；生物信息学分析；萜类化合物；开放中图分类号：S685.160.36
文献标志码：A
文章编号：2095-1191（2018）10-1909-08
Cloningandexpressionanalysisofphosphomevalonatekinase
genefromJasminumsambac（L.）Ait
CHENDi，WANGPeng-jie，ZHENGYu-cheng，ZHENGZhi-lin，
CHENGui-xin*，YENai-xing*
（CollegeofHorticulture，FujianAgricultureandForestryUniversity/KeyLaboratoryofTeaScienceatUniversitiesinFujian，Fuzhou350002，China）
Abstract：【Objective】Phosphomevalonatekinase（PMK）gene（JsPMK）wasclonedfromJasminumsambac（L.）Ait，
anditsbioinformaticswasanalyzed，itsexpressionrhythmicitywasdetectedtoprovidetheoreticalreferenceforstudyingthesynthesispathofterpenoidinJ.sambacanditsregulationmechanism.【Method】J.sambacpetalwasusedasmaterial.ThefulllengthofgeneJsPMKwasamplifiedbyRT-PCR，anditsencodedproteinwaspredictedbybioinformaticssoft-ware.ExpressionsofJsPMKinopeningprocessofJ.sambacwasdetectedbyqRT-qPCR.【Result】Atotalof1951bpfull-lengthofJsPMK（GenBankaccessionnumberMH311042）wasobtained，including1518bpopenreadingframe（ORF）andencodingaproteinof505aminoacidswhichwaslocatedinthecytoplasmandbelongedtonon-secretoryprotein.TheJsPMKproteincontainedtwotypicalconserveddomains—GHMP_kinases_NdomainandGHMP_kinases_Cdomain，andassociatedwithATPbindingsitesGly-X-Gly-XX-AlaintheN-terminal.ThephylogenetictreeindicatedthataminoacidsofJsPMKproteinhadhighaffinitywithPMKproteinofOleaeuropaea，SesamumindicumandSalviamiltiorrhiza（over80%）.Inaddition，thesimilaritybetweenJsPMKproteinandO.europaeawasthehighest.TheresultsindicatedthatPMKproteinofdifferentplantswerehighlyconserved.GeneJsPMKperformedthelowestexpressionwhenJ.sambacwasnotopen（at18：00），andascentedextremely（P<0.01，thesamebelow）asitstartedtobloomandreachedtothemaximumat20：00，thenpresentedextremelydownwardtrend.【Conclusion】GeneJsPMKmaybecontrolledbybiologicalblock，andplayanimportantregulationeffectsinsynthesisofterpenoidandaromareleasinginJ.sambac.
Keywords：Jasminumsambac（L.）Ait；phosphomevalonatekinase（PMK）；genecloning；expressionanalysis；bio-informaticsanalysis；terpenoid；opening
收稿日期：2018-07-09
基金项目：福建省自然科学基金项目（2016J01110）；福州市科技计划项目（2017N0018）作者简介：*为通讯作者：陈桂信（1967-），副教授，主要从事园艺植物遗传育种与生物技术研究工作，E-mail：guixinchen@126.
com；叶乃兴（1963-），教授，主要从事茶树与茉莉花资源利用研究工作，E-mail：ynxtea@126.com。陈笛（1993-），研究方向为茶树栽培育种与生物技术，E-mail：1148050946@qq.com
·1910·南方农业学报49卷0引言
【研究意义】茉莉花［Jasminumsambac（L.）Ait］为木犀科素馨属植物，是一种典型的气质花，多在夜间开放，因其香气芬芳，可用于茉莉花茶窨制、精油提取等，具有极高的经济价值（叶乃兴等，2006；叶秋萍等，2014；叶乃兴和江帆，2017）。茉莉花所含的萜类化合物是茉莉花香气成分中最重要的组分，也是植物次生代谢产物中含量最高、种类最多的一类物质（Yonekura-SakakibaraandSaito，2009）。植物体内合成萜类物质的前体物质为异戊烯焦磷酸（IPP）和丙烯基异构体二甲基丙烯基焦磷酸（DAMPP），主要是由甲羟戊酸（MVA）途径和2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸（MEP）途径代谢而来（李莉等，2008）。MVA途径上游主要有6种关键限速酶，其中磷酸甲羟戊酸激酶（PMK）是催化IPP合成的第5个酶，可催化转移β-磷酸基团的ATP为磷酸氧（R）-5-磷酸甲羟戊酸酯，形成（R）-5-焦磷酸甲酯（RamachandranandShah，1977）。因此，开展茉莉花萜类合成途径限速酶PMK基因克隆及表达研究对其萜类物质的合成及应用具有重要意义。【前人研究进展】目前，有关
PMK基因的研究主要集中在哺乳动物，研究证明
PMK基因突变会导致动物夭折或产生白内障（An-dreassiandLeyh，2004）。Garcial和Keasling（2014）研究表明，酿酒酵母中PMK蛋白的Km随温度的降低而逐渐升高，以30℃最佳，对Mg2+的依赖浓度大于10mmol/L，pH为7.2时可达最大依赖程度。但对于不同物种，PMK的酶动力学值存在显著差异，其原因是不同物种的PMK蛋白序列和结构不同，依据此特性，PMK成为抗菌药物的靶标，具有广阔的应用前景（HoutenandWaterham，2001）。PMK基因在植物中的研究较少。已有研究表明，MVA途径中的PMK蛋白表达水平较低会降低萜类物质的产量Redding-Johansonetal.，2011；Singhetal.，2012），在过表达PMK基因后萜类化合物的产量提高3倍Wooetal.，2013）。Yuan等（2013）对芍药PlPMK基因表达水平与芍药苷等物质积累量的相关性进行研究，结果发现二者显著相关，但PMK基因的表达水平受下游萜类终产物含量的反馈调节（Mazeinetal.，2013）。杨恩泽等（2015）从药用植物阳春砂中克隆出AvPMK基因，证实其与二穗短柄草等单子叶植物的亲缘性较近，且三级结构中含有催化反应的口袋状结构域，具有组织表达特异性，在叶中表达量最高，根茎中最低。何海（2016）研究表明，茯苓PMK是一种对Mn2+依赖性的酶，Mg2+也能激活其部
分活性，能互补酿酒酵母PMK基因（ERG8）功能和催
化5-磷酸甲羟戊酸（MVAP）到5-焦磷酸甲羟戊酸（MVAPP）的可逆反应。赵乐等（2016）从独行菜中克隆出LaPMK基因，并在大肠杆菌中高效表达出LaPMK融合蛋白。【本研究切入点】目前，有关茉莉花香气形成的分子机理研究主要集中在萜类合成酶（TPSs）基因家族及苯丙烷类代谢途径，而针对MVA和MEP途径上游限速酶基因的研究较少（孙君等，2014；俞滢等，2016），尤其有关茉莉花萜类合成途径限速酶PMK基因克隆及其表达的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】克隆茉莉花PMK基因（JsPMK），对其进行生物信息学分析，并采用荧光定量PCR（qRT-PCR）检测JsPMK基因在茉莉花开放过程中的表达量，为有效调控茉莉花香气中萜类物质合成、释香时间及强度等提供理论依据。
1材料与方法
1.1
试验材料
供试材料为双瓣茉莉花，采自福建农林大学教学茶场茉莉资源圃。主要试剂：植物多糖多酚植物总RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，EasyscriptOne-stepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix、Transstart?TipGreenqPCRSu-perMix和TransStartKDPlusDNAPolymerase试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司。1.2RNA提取及cDNA合成
2017年9月，选取茉莉花开放过程中的5个时间点即18：00（未开放）、20：00、22：00、24：00和2：00进行花瓣摘取，每个时间设3个生物学重复。采用植物多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取茉莉花花瓣样本总RNA，并对其浓度、完整性进行检测。以总RNA为模板，参照EasyscriptOne-stepgDNARe-movalandcDNASynthesisSuperMix试剂盒说明反转录成cDNA第一链。1.3引物设计
从茉莉花转录组测序的数据库中筛选出PMK表达序列标签（EST）序列，将超过1000bp的片段进行BLASTx比对，从中获得具有完整开放阅读框（ORF）的PMK基因序列，能编码完整的PMK蛋白，且与其他植物中PMK氨基酸序列相似度较高。根据筛选出的PMK基因同源序列，利用PrimerPremier5.0设计其上、下游引物（表1）。1.4基因克隆
PCR反应体系50.0μL：BufferⅡ10.0μL，cDNA模板1.0μL，dNTP4.0μL，KD酶0.5μL，上、下游引
（（10期陈笛等：茉莉花磷酸甲羟戊酸激酶基因克隆及表达分析
·1911·表1引物名称及序列
Table1Primersandtheirsequences
引物名称PrimerJsPMK-FJsPMK-RActin-FActin-RqJsPMK-FqJsPMK-R
序列Sequence
5'-ATGGCTGTAGTTGCTTCTGCTC-3'5'-CGTTCAAAGCTACCACAAAGTTAC-3'5'-CACTGCTGAGCGGGAAATGT-3'5'-GATCCTCCAATCCAGACACTGT-3'5'-ACCGTCAATGGTTGGTGCTG-3'5'-CCTCTACTTCGTTTGGCTCA-3'
用途FunctionJsPMK基因克隆实时荧光定量PCR（内参基因）实时荧光定量PCR（JsPMK基因）物各1.0μL，ddH2O补足至50.0μL。扩增程序：94℃
预变性5min；94℃30s，56℃30s，68℃90s，进行35个循环；68℃延伸10min。后续PCR产物回收、连接、转化等参照姚雪倩等（2017）的方法进行，挑取阳性克隆送至北京六合华大基因科技有限公司测序。1.5qRT-PCR检测
以茉莉花花瓣cDNA为模板，qJsPMK-F和qJsPMK-R（表1）为荧光定量引物，参照Transstart?TipGreenqPCRSuperMix试剂盒说明进行qRT-PCR检测，设3个生物学重复，以Actin为内参基因。反应体系10.0μL：qPCRSuperMix5.0μL，cDNA模板1.0μL，上、下游引物各0.2μL，ddH2O补足至10μL。扩增程序：94℃预变性30s；94℃5s，60℃30s，进行40个循环。
1.6生物信息学分析
通过NCBI在线查找JsPMK基因同源性序列，利用MEGA7.0构建系统进化树；采用DNAMAN进行多序列比对；利用Protparam进行蛋白质理化性质预测；利用TMHMMServerV.2.0和SignalP4.1进行跨膜区和信号肽预测；采用NetPhos2.0Server进行蛋白磷酸化预测；利用WoLFPSORT进行亚细胞定位；采用InterPro分析蛋白的结构功能域；利用SPOMA预测蛋白质的二级结构。1.7统计分析
JsPMK基因相对表达量采用2-??Ct法进行计算，并利用SPSS19.0进行显著性分析，采用Graphpadprism制作柱状图。
2结果与分析
2.1
JsPMK基因克隆及序列分析结果
PCR扩增结果如图1所示，目标条带单一且清
晰，约2000bp，与预期结果相符。测序结果（图2）显示，该片段约1951bp，具有完整的ORF（1518bp），编码505个氨基酸。BLASTx比对分析结果表明，此序列可编码完整的PMK蛋白，且与其他植物中的PMK氨基酸序列相似度较高，均在70%以上。因此，确定该片段为JsPMK基因，将其序列提交至GenBank，登录号为MH311042。
M
1
2000bp
1000bp750bp500bp250bp100bp
图1JsPMK基因PCR扩增电泳结果
Fig.1PCRamplificationelectrophoresisresultsofgeneJsPMKM：DL2000DNAMarker；1：JsPMK基因GeneJsPMK
2.2
JsPMK蛋白的理化性质预测结果Protparam预测结果显示，JsPMK蛋白分子式为C2395H3842N644O749S19，相对分子质量为54251.86，理论等电点为5.33，不稳定系数为36.80，为稳定蛋白。TMHMMServerV.2.0和SignalP4.1预测结果显示，JsPMK蛋白位于细胞膜表面，无跨膜螺旋区，推测该蛋白是与细胞信号传导有关的膜蛋白，且蛋白N端存在信号肽可能性较低，为非分泌蛋白。亚细胞定位结果显示，JsPMK蛋白位于细胞质中，推测其在细胞质内起始合成后未进行蛋白转运，而是留在细胞质基质发挥催化作用。NetPhos2.0Server预测结果显示，JsPMK蛋白含19个Ser位点、5个Thr位点和4个Tyr位点。SPOMA预测结果显示，JsPMK蛋白主要由α-螺旋（41.58%）、无规则卷曲（40.59%）、延长链13.86%）和β-折叠（3.96%）构成（图2）。推测其α-螺旋结构会影响底物与ATP的结合（AndreassiandLeyh，2004）。
2.3JsPMK蛋白的同源比对及结构域分析结果
BLASTx同源比对分析结果（图4）表明，JsPMK蛋白的氨基酸序列与野生油橄榄（Oleaeuropaea，XP_02-28862731.1）、丹参（Salviamiltiorrhiza，AEZ-55665.1）、芝麻（Sesamumindicum，XP_011074642.1）和野生种番茄（Solanumpennellii，XP_015077369.1）等植物的PMK蛋白具有较高的相似性，分别达88%、82%、82%和81%。可见，不同植物PMK蛋白的氨基
（
___________茉莉花磷酸甲羟戊酸激酶基因克隆及表达分析___________
