2020大肠杆菌的分型方法及其研究进展
肠埃希氏菌是一种条件性致病菌，致病性的大肠埃希氏菌具有高度的传染性，会严重危害健康。快速准确地测定大肠埃希氏菌的污染来源对有效缩小疫情影响范围极有帮助，从而避免对人类健康和经济贸易造成重大损失。建立简便高效的分型方法是微生物溯源的关键，常见的大肠埃希氏菌分型方法可分为表型分型和分子分型，这些分型方法各有优劣，具有不同的适用范围。
大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E. coli)又称大肠杆菌，属革兰氏阴性菌，于1885年首次被发现[1]，是人和动物体内的正常寄居菌。大肠埃希氏菌是一种条件致病菌，在正常情况下不致病，然而一些特殊血清型菌株可导致人或动物腹泻、腹痛甚至会产血性粪便，重症病例会并发溶血性的尿毒综合征以及血小板减少性紫癜[2-3]。
根据大肠埃希氏菌对人类的致病机理不同，可将其分为5种类型：
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肠致病性大肠埃希氏菌(Enteropathogenic escherichia coli，EPEC) 肠产毒性大肠埃希氏菌(Enterotoxigenic escherichia coli，ETEC) 肠侵袭性大肠埃希氏菌(Enteroinvasive escherichia coli，EIEC) 肠出血性大肠埃希氏菌(Enterohemorrhagic escherichia coli，EHEC) 肠集聚性大肠埃希氏菌(Enteroaggregative escherichia coli，EAEC) 大肠埃希氏菌的肠道传染具有比较广泛的特性，而食品在生产、包装及运输过程中极易感染此菌，进而引发传染性疾病[5]。2018年6月，大肠埃希氏菌O157:H7污染生菜事件的暴发，影响了美国36个州，事件造成96人住院和5人死亡[6]。
2019年4月，美国的10个州暴发牛肉感染大肠埃希氏菌O103事件，导致177人感染，其中21人住院，涉事公司紧急召回了53 200磅牛肉[7]。大肠埃希氏菌是一些传染性疾病的重要来源之一，致病性的大肠埃希氏菌严重威胁着人类健康[8]。迅速确定大肠埃希氏菌的污染来源可有效缩小疫情影响范围，避免对人类健康和经济贸易产生重大损失。根据大肠埃希氏菌表面抗原的不同，大肠埃希氏菌可分为1 000多种血清型[9]，建立简便高效的追溯技术和分型方法是微生物溯源的关键。
大肠埃希氏菌的常见分型方法可分为表型分型和分子分型，这两种类型的分型方法各有优劣，具有不同的适用范围，随着分子生物学和生物信息学等学科的迅速发展，大肠埃希氏菌的分型方法不断地被丰富和完善，国内对大肠埃希氏菌的分型方法综述尚未见报道。本文围绕表型分型方法和分子分型方法综述了国内外大肠埃希氏菌分型的研究进展，为致病菌溯源方法的选择提供参考依据，对防御并控制致病菌引起的流行病传播具有重要的意义。
1、表型分型方法
表型分型方法是以各种微生物基因产物发生的生物化学反应为基础来判断微生物菌体种类的一类分型方法[10]。表型分型方法具有多方优势，如分型成本低、操作技术简单、不需要大型分析仪器和设备、一次可进行大批量样本分析等[11]，因此在基层应用比较广泛[12]。然而，此类方法的鉴定结果容易受到菌体生存条件和培养条件的影响，导致鉴定结果不够准确和稳定，还需要其他分型方法的补充和验证[13-14]。常用的表型分型方法有血清分型和噬菌体分型[15]。
1.1 血清分型
血清分型是大肠埃希氏菌表型分型中最常用的方法之一，也是鉴定大肠埃希氏菌是否含有致病性的最重要方法。大肠埃希氏菌的抗原结构较复杂，可归为4类抗原：菌体抗原(O抗原)、表面抗原(K抗原)、鞭毛抗原(H抗原)和菌毛抗原(F抗原)[16]。大肠埃希氏菌的血清分型是基于O抗原、K抗原和H抗原来进行分型，研究表明大肠埃希氏菌的K抗原、H抗原与O抗原具有一定程度的相关性，F1、F11菌毛抗原与O78、O1、O2三种菌体抗原型菌株之间存在较为显著的相关性[17]，因此通常在大肠埃希氏菌病的诊断过程中，若仅以鉴定O抗原难以达到预想的分型效果。血清分型的鉴定方法是通过血清凝集实验来实现的，血清凝集实验是通过高温(100 ℃，2 h)处理菌株获得菌株表面O抗原，基于免疫共沉淀的原理，O抗原与相应抗体结合，在电解质存在的条件下，经过一段时间可出现肉眼可见的凝集小块，以此来判断是否有目标抗原存在。
目前已知的大肠埃希氏菌O抗原血清型有170种，在中国已经有50多种致病性大肠埃希氏菌血清型被成功分离和鉴定[18]。高崧等[19]运用血清分型对595株大肠埃希氏菌进行了分析，发现6个血清型为优势血清型，分别是O18、O78、O2、O88、O11和O26。2003年我国颁布的《致泻大肠埃希氏菌检验国家标准》[20]采用的是血清分型方法，2016年修订了新的国家标准[21]，采用的是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)对5种致泻大肠埃希氏菌的14种特征基因进行扩增，进而判断结果。有些菌株属于不可分型，例如有一些菌株因O抗原的相关基因发生突变或者丢失，导致丧失合成O抗原的能力，则不与抗血清发生凝集反应，这些菌株不能通过血清分型鉴定[22]。血清分型依
据细菌表面的单一抗原表位来对目标菌进行分型，不能将菌株之间的遗传关系完全反映出来，可能存在具有相同血清型但菌株之间遗传关系相差很远的现象，不同菌株致病性可能存在巨大差异，此时运用血清分型方法会影响分型的效果，导致鉴定结果不准确[23]。
由于血清分型方法具有操作简单、易于掌握的特点，在基层得到了广泛的应用，但传统的血清学分型方法也有一定的缺陷，如耗时长、费用高，不利于大规模应用，敏感性也不高，需要重复检测才能得出结果。此外，该方法要求鉴定的致病菌纯度尽可能高、保持新鲜并传代次数较少，并且还要求标准免疫血清和标准菌株具备特异性强和滴度高的特点。分型结果会受到很多因素的影响，如血清质量、血清来源、血清交叉反应以及菌体表面其他抗原成分，使得检测准确度、检出率和灵敏度很难达到理想的效果[24]。
1.2 噬菌体分型
噬菌体是一类能够感染细菌、真菌等微生物的病毒，主要结构是由蛋白质外壳包裹着遗传物质。噬菌体可以通过蛋白质外壳与宿主细菌表面的受体特异性结合，将自身的遗传物质注入宿主细菌体内。噬菌体对宿主细菌的感染和裂解作用通常具有较高的特异性。噬菌体分型方法的原理就是依据噬菌体与相应细菌具有特异性的裂解作用，能够在培养基上形成直观清晰的噬菌斑来确定宿主细菌的种类[25]，通常被用于区分不同的细菌亚型。
噬菌体分型在众多细菌分型方法中扮演着非常重要的角色，常作为联合分型方法受到广泛运用[26]。李萌等[27]通过对肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7的研究
发现，由于该类型菌株的高度保守性，对其引起的流行病学检测研究必须采用不同种类的分型方法，比较不同分型方法的实验结果后发现噬菌体分型方法具有较高的分辨率，可将66种详细类别的大肠埃希氏菌O157:H7分离出来。
噬菌体分型具有高特异性和成本低廉的优点，并具有可区分活细菌和死细菌的能力，较易运用于其他检测领域，目前基于噬菌体识别食源性致病菌的模式已在检测领域得到广泛的应用[28]。然而，此方法对噬菌体的用量、侵染时间等一系列条件有特殊的要求，通常需要较长时间，对操作人员的实践能力和操作技术要求较高，噬菌体分型方法的使用受到限制[29]。
2、分子分型方法
分子分型方法基于致病菌(病原体)的遗传物质(DNA)，通过构建不同细菌个体的“DNA指纹”文库，将分离得到的细菌样本与可能的污染源(食品、粪便等)分离得到的同类细菌样本的“DNA指纹”进行分析对比，从而判断致病菌的污染来源[30]。常见的分子分型方法包括脉冲场凝胶电泳分型技术、多位点序列分型技术、限制性片段长度多态性分型技术、随机引物扩增多态性DNA分型技术、扩增片段长度多态性分型技术、变性高效液相色谱分型技术、重复序列聚合酶链反应分型技术、成簇的规律间隔的短回文重复序列分型技术、质粒图谱分型技术和单核苷酸多态性分型技术等分型方法。
2.1 脉冲场凝胶电泳分型技术 脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分型技术在1984年由Schwartz和Cantor首次提出[31]，其原理是在脉冲电场的作用下，可分离大于20 kb以及小于5 Mb的DNA
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