平板计数法

稀释平板计数法

实验目得

学习稀释平板菌落计数得基本原理与方法。 实验内容

用稀释平板菌落计数法对菌悬液进行计数。 实验原理

平板菌落计数法就是将待测样品经适当稀释之后,其中得微生物充分分散成单个细胞,取一定量得稀释样液接种到平板上,经过培养,由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见得菌落,即一个单菌落应代表原样品中得一个单细胞。统计菌落数,根据其稀释倍数与取样接种量即可换算出样品中得含菌数、但就是,由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞,所以,长成得一个单菌落也可能来自样品中得2—3或更多个细胞。因此平板菌落计数得结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数得结果,现在已倾向使用菌落形成单位(ｃfu)而不以绝对菌落数来表示样品得活菌含量。

平板菌落计数法虽然操作较繁,结果需要培养一段时间才能取得,而且测定结果易受多种因素得影响,但就是,由于该计数方法得最大优点就是可以获得活菌得信息,所以被广泛用于生物制品检验(如活菌制剂),以及食品、饮料与水〔包括水源水〕等得含菌指数或污染程度得检测。 实验器材 酿酒酵母菌悬液 马铃薯培养基

1ｍ1吸管,平皿,试管,试管架,恒温培养箱等、 实验步骤 1.无菌器材得准备

(１) 无菌培养皿:取培养皿９套,包扎、灭菌。

(２) 无菌移液管得准备:取1ｍ１移液管,在后部管口处用铁丝塞入棉花少许(长约1~１、５cm ),以防将菌液吸出,同时也可避免将外面得微生物吹入。棉花要塞得松紧适宜吹时能通气但不使棉花滑下为准。然后将移液管尖端放在４~5cm宽得长纸条一端呈４5o角折叠纸条包住尖端,用左手捏住管身,右手将吸管压紧,在桌面上向前滚动,以螺旋式包扎起来,上端剩余纸条折叠打结后干热灭菌。

(3) 无菌水:取6支试管,分别装入4。５m1蒸馏水,加棉塞,灭菌。 ２。样品稀释液得制备 (1) 编号

取无菌平皿9套,分别用记号笔标明１０

——４

、10

—５

、１06(稀释度)各3套、另取6支盛

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—

—

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有4。５m１无菌水得试管,依次标就是１０1、10-2、１03、１04、105、106。 (２) 稀释

－1

用１m1无菌吸管吸取1m1己充分混匀得菌悬液(待测样品),精确地放0。５ml至１0得试管中,此即为1０倍稀释。将多余得菌液放回原菌液中。

将10

—1

试管置试管振荡器上振荡,使菌液充分混匀。另取一支1m１吸管插入10-1试管中

来回吹吸菌悬液三次,进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快,吸时吸管伸入管底,吹时离开液面,以免将吸管中得过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取１0菌液1ｍｌ,精确地放0.５ｍl至1０程如图所示、

放菌液时吸管尖不要碰到液面,即每一支吸管只能接触一个稀释度得菌悬液,否则稀释不准确,结果误差较大。 3。平板接种培养

平板接种培养有浇注平板培养法与涂布平板培养法两种方法、 (1) 浇注平板培养法 １) 取样

用三支1mｌ无菌吸管分别吸取１０4、10-5、与1０编好号得无菌平皿中,每个平皿放０。2ml。

不要用1ml吸管每次只靠吸管尖部吸０。2ml稀释菌液放入平皿中,这样容易加大同一稀释度几个重复平板间得操作误差。 2) 倒平板

尽快向上述盛有不同稀释度菌液得平皿中倒人融化后冷却至4５℃左右得培养基约15毫升／平皿,置水平位置迅速旋动平皿,使培养基与菌液混合均匀,而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。待培养基凝固后,将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养、

由于细菌易吸附到玻璃器皿表面,所以菌液加入到培养皿后,应尽快倒入融化并己冷却至45℃左右得培养基,立即摇匀,否则细菌将不易分散或长成得菌落连在一起,影响计数。

－

—6

—2

—１

试管中,此即为10０倍稀释。……其余依次类推,整个过

得稀释菌悬液各1ml,对号放入

(2) 涂布平板计数法:

平板菌落计数法得操作除上述倾注倒平板得方式以外,还可以用涂布平板得方式进行、

二者操作基本相同,所不同得就是后者先将培养基融化后倒平板,待凝固后编号,并于37℃左右得温箱中烘烤３０min,或在超静工作台上适当吹干,然后用无菌吸管吸取稀释好得菌液对号接种于不同稀释度编号得平板上,并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀,平放于实验台上20—30 min,使菌液渗入培养基表层内,然后倒置于得恒温箱中培养2４-48h、

涂布平板用得菌悬液量一般以0。1ml较为适宜,如果过少,菌液不易涂布开;过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动,不易形成单菌落。 4.计数

培养４８h后,取出培养平板,算出同一稀释度三个平板上得菌落平均数,并按下列公式进行计算:

每毫升中菌落形成单位(cｆu)=同一稀释度三次重复得平均菌落数×稀释倍数×5

一般选择每个平板上长有3０—300个菌落得稀释度计算每毫升得含菌量较为合适、同一稀释度得三个重复对照得菌落数不应相差很大,否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个,这样便于数据统计,减少误差。由10-4、１05、10释度计算出得每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大、

平板菌落计数法,所选择倒平板得稀释度就是很重要得、一般以三个连续稀释度中得第二个稀释度倒平板培养后所出现得平均菌落数在50个左右为好,否则要适当增加或减少稀释度加以调整。

下面就是食品中微生物得计数,可能包含多种菌

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—6

三个稀

(二)倾注培养

1。操作方法:根据标准要求或对污染情况得估计,选择2~３个适宜稀释度,分别在制10倍递增稀释得同时,以吸取该稀释度得吸管移取1ｍl稀释液于灭菌平皿中,每个稀释度做两个平皿。

将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml,并转动平皿,混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液(不含样品)得灭菌平皿内作空白对照、

待琼脂凝固后,翻转平板,置３6±1℃温箱内培养４8±2h,取出计算平板内菌落数目,乘以稀释倍数,即得每克(每毫升)样品所含菌落总数。

2.倾注用培养基应在４6℃水浴内保温,温度过高会影响细菌生长,过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴,应以皮肤感受较热而不烫为宜。

倾注培养基得量规定不一,从12～2０ml不等,一般以１5mｌ较为适宜,平板过厚可影响观察,太薄又易于干裂。倾注时,培基底部如有沉淀物,应将底部弃去,以免与菌落混淆而影响计数观察。

3。为使菌落能在平板上均匀分布,检液加入平皿后,应尽快倾注培养基并旋转混匀,可正反两个方向旋转,检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过2０min,以防止细菌有所死亡或繁殖。、

４、培养温度一般为37℃(水产品得培养温度,由于其生活环境水温较低,故多采用30℃)。培养时间一般为4８h,有些方法只要求24ｈ得培养即可计数、培养箱应保持一定得湿度,琼脂平板培养48h后,培养基失重不应超过15%。

５、为了避免食品中得微小颗粒或培基中得杂质与细菌菌落发生混淆,不易分辨,可同时作一稀释液与琼脂培基混合得平板,不经培养,而于４℃环境中放置,以便计数时作对照观察。

在某些场合,为了防止食品颗粒与菌落混淆不清,可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑(TTC),培养后菌落呈红色,易于分别、 (三)计数与报告

1.操作方法:培养到时间后,计数每个平板上得菌落数。可用肉眼观察,必要时用放大镜检查,以防遗漏。在记下各平板得菌落总数后,求出同稀释度得各平板平均菌落数,计算处原始样品中每克(或每ml)

中得菌落数,进行报告。

2、到达规定培养时间,应立即计数、如果不能立即计数,应将平板放置于0－4℃,但不得超过2４h。

3。计数时应选取菌落数在３0~300之间得平板(SN标准要求为２５～2５０个菌落),若有二个稀释度均在30~3０0之间时,按国家标准方法要求应以二者比值决定,比值小于或等于2取平均数,比值大于2则其较小数字(有得规定不考虑其比值大小,均以平均数报告)。

4.若所有稀释度均不在计数区间。如均大于3０0,则取最高稀释度得平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于３０,则以最低稀释度得平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有得大于3０0,有得又小于30,但均不在30～300之间,则应以最接近300或3０得平均菌落数乘以稀释倍数报告之、如所有稀释度均无菌落生长,则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有得规定对上述几种情况计算出得菌落数按估算值报告。

５.不同稀释度得菌落数应与稀释倍数成反比(同一稀释度得二个平板得菌落数应基本接近),即稀释倍数愈高菌落数愈少,稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象,则应视为检验中得差错(有得食品有时可能出现逆反现象,如酸性饮料等),不应作为检样计数报告得依据。

６.当平板上有链状菌落生长时,如呈链状生长得菌落之间无任何明显界限,则应作为一个菌落计,如存在有几条不同来源得链,则每条链均应按一个菌落计算,不要把链上生长得每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长,该平板一般不宜采用,如片状菌落不到平板一半,而