中国组织工程研究 第20卷 第38期 2016-09-16出版
Chinese Journal of Tissue Engineering Research September 16, 2016 Vol.20, No.38
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·研究原著·
重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料的制备与性能 刘启省，张东刚 (同济大学，上海市 200000；烟台正海生物科技股份有限公司，山东省烟台市 264000)
引用本文：刘启省，张东刚. 重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料的制备与性能[J].中国组织工程研究，2016，20(38):5664-5671. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.38.006 ORCID: 0000-0002-5916-6596(刘启省)
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重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料释放、活性及诱导异位成骨的能力 制备重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料 1
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采用ELISA法检测重组人骨形态发生蛋白2的体外释放情况 重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料保证了重组人骨形态发生蛋白2的稳定性使其不易释放，提高了其异位诱导成骨能力 将C2C12细胞滴加到重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料上，72 h后检测细胞碱性磷酸酶活性 刘启省，男，1986年生，山东省曹县人，汉族，同济大学在读硕士，中级工程师，主要从事生物医药与组织工程材料等相关工作。
中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2016)38-05664-08 稿件接受：2016-07-09
将重组人骨形态发生蛋白2的重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料分别埋置于SD大鼠肌肉内，埋置2，4周后，检测磷酸酶活性与新骨生长情况 将CY7标记的重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料埋置于SD大鼠后肢肌肉窝内，观察重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料的稳定性
文题释义：
重组人骨形态发生蛋白/骨修复材料：具有良好的生物相容性和力学性能，保留了自然骨的天然结构，重组人骨形态发生蛋白与骨修复材料特异性结合，克服了重组人骨形态发生蛋白在体内不易扩散和易降解的缺点，并实现重组人骨形态发生蛋白2的缓慢释放。能更好的满足创伤、感染、肿瘤及发育异常等原因所导致的骨缺损的修复要求，将在创伤修复领域特别是骨缺损的修复中发挥巨大作用。 骨形态发生蛋白2：主要对未分化间充质细胞和骨系细胞起到聚集和分化作用。在骨形成早期，骨形态发生蛋白2不仅可使未分化间质细胞向骨形成中心聚集并分化为骨细胞，而且可使成纤维细胞、成肌细胞及骨髓基细胞逆转分化为骨细胞。
摘要
背景：制备具有天然骨结构，能够结合生物因子的骨修复材料成为研究的热点。
目的：制备重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料，评估其释放、活性及诱导异位成骨的能力。
方法：首先制备含有胶原结合域的重组人骨形态发生蛋白2，然后将胶原结合域与骨修复材料中的胶原相结合，经过冷冻干燥制备重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料，采用ELISA法检测重组人骨形态发生蛋白2的体外释放情况。将C2C12细胞滴加到重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料上(重组人骨形态发生蛋白2剂量分别为0.25，0.5，1 μg/块)，72 h后检测细胞碱性磷酸酶活性。将含0，2，5，10 μg重组人骨形态发生蛋白2的重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料分别埋置于SD大鼠肌肉内，埋置2，4周后，检测磷酸酶活性与新骨生长情况。将CY7标记的重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料埋置于SD大鼠后肢肌肉窝内，观察重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料的稳定性。
结果与结论：重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料内的重组人骨形态发生蛋白2在45 d内基本没有释放；C2C12细胞的碱性磷酸酶活性随复合材料中重组人骨形态发生蛋白2剂量的升高而升高；重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料植入体内的稳定性较好，碱性磷酸酶活性、异位成骨随重组人骨形态发生蛋白2剂量的增加而升高。结果表明，重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料保证了重组人骨形态发生蛋白2的稳定性，使其不易释放，提高了其异位诱导成骨能力。 关键词：
生物材料；骨生物材料；重组人骨形态发生蛋白2；基因工程；骨修复材料；骨缺损；释放；异位成骨；
主题词：
骨形态发生蛋白质类；碱性磷酸酶；组织工程
缩略语：
骨形态发生蛋白2：bone morphogenetic protein2，BMP-2
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刘启省，等. 重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料的制备与性能
Liu Qi-sheng, Studying for master’s degree, Intermediate engineer, Tongji University, Shanghai 200000, China
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Preparation and properties of recombinant human bone morphogenetic protein-2/ bone repair material
Liu Qi-sheng1, Zhang Dong-gang2 (1Tongji University, Shanghai 200000, China; 2Zhenghai Biotechnology Limited Company of Yantai, Yantai 264000, Shandong Province, China)
Abstract
BACKGROUND: It has become a hotspot to prepare the bone repair material that exhibits natural bone structure and is used in combination with biological factors.
OBJECTIVE: To prepare the recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2)/bone repair material, and to evaluate its capacities of release, activity and ectopic osteoinduction.
METHODS: A collagen-binding domain was added to the N-terminal of native rhBMP-2 that allowed bind to collagens in the bone repair material. Then, rhBMP-2/bone repair material was obtained
through freeze-dried method. The releasing ability of rhBMP-2 in vitro was assayed by ELISA. C2C12 cell lines were loaded to the composite material with 0.25, 0.5 and 1 μg rhBMP-2, respectively.
Afterwards, alkaline phosphatase activity was detected at 72 hours. The composite materials with 0, 2, 5 and 10 μg rhBMP-2 were implanted into the quadriceps of Sprague-Dawley rats, respectively. Alkaline phosphatase activity and the newly formed bone were detected at 2 and 4 weeks after implantation. The CY-7-labeled composite material was implanted into the quadriceps of Sprague-Dawley rats to observe its stability.
RESULTS AND CONCLUSION: Substantially no rhBMP-2 from the rhBMP-2/bone repair material was released within 45 days. The alkaline phosphatase activity of C2C12 was in a rise with the increased concentration of rhBMP-2. The stability of the composite material in vivo was better, the alkaline
phosphatase activity and ectopic bone formation increased as the concentration of rhBMP-2 rose. To conclude, the rhBMP-2/bone repair material preserves the stability of rhBMP-2, and improves ectopic osteoinduction ability.
Subject headings: Bone Morphogenetic Proteins; Alkaline Phosphatase; Tissue Engineering
Cite this article: Liu QS, Zhang DG. Preparation and properties of recombinant human bone morphogenetic protein-2/bone repair material. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(38):5664-5671.
[6]
0 引言 Introduction
临床中骨缺损最常用的方法为自体骨移植和异体骨移植，自体骨供体的有限性及供骨区的相关并发症限制了其应用，增加了患者痛苦；而异体骨则具有较大的抗原性，容易产生剧烈的免疫排斥反应，导致植骨失败。因此，寻找和开发能够替代自然骨的人工骨修复材料，成为组织工程领域中一个亟需解决的问题。制备具有与天然骨结构、组分及功能均相似的仿生型骨支架成为骨组织工程中的研究热点。理想的骨修复材料应接近天然骨，在生物学性能上要求达到：①组织相容性好，置入体内后不产生免疫排斥反应；②有骨传导性：保持了天然骨的三维结构，有利用血管、神经的进入；③有骨诱导性：材料中有利于成骨的生物大分子并在新骨的生成过程中逐步降解
[2-3]
[1]
细胞向成骨细胞方向增殖和分化，促进成骨，使成纤维细胞具有成骨表型
[7-8]
。然而，BMP-2在体液中扩散快
速，半衰期短，容易酶解，治疗浓度降低快，不能持续刺激靶细胞以充分发挥其诱导活性。而通过提高BMP-2的使用剂量来促进成骨，则会因为剂量太高产生一系列并发症，可能导致组织肿胀、产生炎症，促进不期望的异位骨生成，还可在骨痂内形成囊肿样病变
[9-16]
。所以，
目前的研究热点是将BMP-2与载体结合，建立稳定的BMP-2释放系统，减少BMP-2的释放以维持植入位点局部浓度，降低并发症的发生率，使BMP-2能够发挥更大的作用
[17]
。
中国科学院戴建武等发现一段含7个氨基酸具有胶原靶向结合能力的寡肽，即胶原结合域(collagen- binding domain，CBD)，将胶原结合域通过肽键与BMP-2的N端结合，形成具有胶原靶向结合能力的重组人BMP-2，将重组人BMP-2溶于水与胶原浸泡时，重组人BMP2会通过其胶原结合域的氨基酸侧链与Ⅰ型胶原形成共价键实现结合，构建一种新的重组人BMP-2局部
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。
在已知的生长因子中，骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein2，BMP-2)的成骨作用最强。已有研究证实BMP-2对成骨细胞、软骨细胞的分化及功能具有重要的调节作用
[4-5]
，它能跨种诱导未分化间充质干
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释放系统，实现重组人BMP-2持续缓慢释放[18-19]
。据此，通过基因工程方法制备包含胶原结合域的重组人BMP-2，将具有胶原靶向结合能力的重组人BMP-2与骨修复材料(主要成分为胶原和羟基磷灰石)结合，建立新的重组人BMP-2缓释系统，形成理想的具有骨诱导性的重组人BMP-2/骨修复材料。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 观察对比实验。
1.2 时间及地点 实验于2015年10月至2016年1月在同济大学完成。
1.3 材料 C2C12细胞购于中国协和医科大学基础医学所细胞中心。
实验动物：五六周龄雄性SD大鼠，体质量180-
200 g，由山东绿叶制药有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK鲁20090009。
骨修复材料：由烟台正海生物科技股份有限公司提
供，商品名海奥?骨修复材料，是已获得SFDA注册批准的Ⅲ类医疗器械，主要成分为胶原蛋白和羟基磷灰石，保留了天然的胶原蛋白成分与骨天然结构，利于吸附内源性生长因子。
主要试剂与仪器：胎牛血清、DMEM高糖培养基
(Gibco)；碱性磷酸酶检测试剂盒、人BMP-2 ELISA Kit(sigma)；高压均质机(APV-2000)；离心机(thermo)；415型台式原位灭菌发酵罐(New Brunswick BioFlo)；电子天平(PL202)；超声波细胞粉碎机(JY99-IID)；XHF-D高速分散器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；多功能活体成像系统(FxPro)。 1.4 实验方法
1.4.1 重组人BMP-2/骨修复材料的制备
重组人BMP-2菌种的制备：中科院遗传与发育生物
学研究所戴建武博士组完成质粒重组、细菌转化及单克隆筛选等菌种制备工作，提供了能高效表达包含CBD区域的重组人BMP-2菌种。
重组人BMP-2高密度发酵：将工程菌无菌操作划平
板37 ℃培养12-18 h，以菌落直径1.0-2.0 mm为宜，用接种环挑选单克隆接种于100 mL含卡那霉素(30 mg/L)的LB培养基中37 ℃振荡培养4 h，作为一级种子液，将培养好的一级种子液接种于300 mL含卡那霉素(30 mg/L)的LB培养基中，37 ℃振荡培养12-18 h，种子A600值应达到4.0-6.0，作为二级种子液。将二级种子液接种到发酵罐中，37 ℃搅拌培养5 h，至A600值达到20以上时加入终
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浓度为1 mmol/L的IPTG，相同条件下继续诱导培养5 h。培养结束后，离心收集菌体。重悬菌体制成菌悬液，分别采用高速分散器、APV均质机、超声波破碎仪等手段重悬、破碎菌体后，低温高速离心收集包涵体。
重组人BMP-2的纯化和复性：将包涵体以1 g包涵
体：10 mL溶解液的比例溶解于包涵体裂解液中，高速分散器3 000 r/min剪切3 min，然后在恒温摇床中25 ℃温和振荡6 h，12 000×g高速离心30 min，收集上清液，再经0.45 μm滤膜过滤即为包涵体裂解液。包涵体裂解液分别经过离子交换层析、蛋白复性、肝素亲和层析、凝胶过滤层析等纯化过程得到重组人BMP-2原液，蛋白纯度可达到95%以上。按照《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》对重组人BMP-2原液进行检测，其生物学活性、蛋白质含量、蛋白纯度、分子量、外源性DNA残留量、宿主菌蛋白残留量、残余抗生素活性、细菌内毒素检查、等电点、紫外光谱扫描、肽图、N-末端氨基酸序列均符合规定。
重组人BMP-2/骨修复材料的制备：配制一定量的重
组人BMP-2溶液，将其加入预灭菌的骨修复材料(混合比例为5 mL∶1 g)半成品，25 ℃温和震荡孵育2 h，然后再经过冷冻干燥，分装，60
Co辐照灭菌，即得重组人BMP-2/骨修复材料。
1.4.2 重组人BMP-2/骨修复材料体外释放实验 将重组人BMP-2/骨修复材料放置于15 mL的离心管内，加入10 mL PBS(pH=7.4)，37 ℃温和振荡，分别于6 h、1 d、5 d取样，之后每隔5 d取样1次，每次取样200 μL/次，使用人BMP2 ELISA Kit检测洗脱释放情况。绘制重组人BMP-2的累计释放曲线。以CHO表达的天然BMP-2直接滴加的方式制备BMP-2/骨修复材料作为对照，比较两组材料重组人BMP-2释放情况。
1.4.3 重组人BMP-2/骨修复材料的体外活性检测 BMP-2对C2C12细胞具有强烈的转分化作用，可抑制其向肌细胞方向分化转而向成骨细胞方向分化，因此可通过C2C12细胞对重组人BMP-2的活性进行检测。将骨修复材料(空白对照组)、含有一定重组人BMP-2的(0.25，0.5，1 μg/块)重组人BMP-2/骨修复材料(样品组)提前浸泡于DMEM高糖培养基中，37 ℃浸泡4 h。用完全培养基培养C2C12细胞，长至70%-80%的融合度时，将细胞消化，接将消化后的细胞以2×105
/块滴加到骨修复材料和重组人BMP-2/骨修复材料上，继续培养72 h后检测碱性磷酸酶活性。阴性对照组为不经过任何处理的C2C12细胞，阳性对照组为向C2C12细胞中加入0.25，
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0.5，1 μg的重组人BMP-2原液。 布情况。实验第 21 天，将动物处死，取心脏、肝脏、肾 1.4.4 重组人BMP-2/骨修复材料在大鼠体内的异位诱导成骨情况及其剂量依赖关系
实验分组及干预：取检疫合格SD大鼠，按体质量
随机分5组，每组10只，A-D组植入重组人BMP-2 /骨修复材料，其对应重组人BMP-2的剂量分别为0，2，5，10 μg/块。处理方法为用手术刀在大鼠股四头肌切开约 1 cm长的切口，切开肌肉层后，在肌肉层埋植对应重组人BMP-2 /骨修复材料，两侧埋植，每侧植入1块；E组为肌肉注射组，处理方法为在大鼠股四头肌处注射5 μg BMP-2原液，两侧注射，每侧注射5 μg。
碱性磷酸酶活性测定：术后2，4周每组各处死5只
动物，2周时取两侧植入材料，4周时取一侧植入材料(另一侧做切片)，去除周围肌肉组织，称质量并记录，剪碎，加入生理盐水5 mL，匀浆5 000 r/min离心14 min，取上清液，检测碱性磷酸酶活性(U)，再以标本湿质量(mg)为除数，即得碱性磷酸酶的活性(U/mg)。
诱导新骨生长情况：术后4周，取出植入材料，常
规组织切片，苏木精-伊红染色，观察材料诱导新骨生长情况等。采用Image-Pro Plus 6.0软件分析新生骨占总组织面积的比值。
1.4.5 重组人BMP-2/骨修复材料的体内稳定性及降解后分布情况
CY-7标记重组人BMP-2/骨修复材料的制备：骨修复材料作为载体，它在体内的稳定性及对重组人BMP-2的缓释是一个关键性因素，花菁染料CY-7是性能优良的荧光标记染料，摩尔吸光系数在荧光染料中是最高的，常被应用于生物分子标记，荧光成像及其他荧光生物分析。在过去几十年间，花菁染料作为一种稳定的光谱敏化剂
[20-23]
，被广泛应用于光学成像
[24]
、生物医药制药
[25]
、
非线性光学与激光物理学，特别是单分子检测技术等各种光物理学和光化学研究之中。为了保证系统的灵敏性与特异性，实验采用了再荧光染料中摩尔吸光系数最高的CY-7来标记重组人BMP-2，获得重组人BMP-2标记CY-7荧光染料，每块骨含有25 μg重组人BMP-2。
实验分组干预：取雄性健康SD大鼠，用手术刀在
大鼠后肢肌肉窝切开约1 cm长的切口，切开肌肉层后，在肌肉层埋植不含重组人BMP-2骨修复材料的作为对照组，埋置重组人BMP-2/骨修复材料(标记CY-7)的作为实验组，每组2只大鼠。
术后0 h、4 h、8 h、24 h、48 h、72 h、7 d、10 d将两组大鼠麻醉，进行活体荧光，观察蛋白在体内的分
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脏、脾脏、肺等脏器进行荧光观察，观察蛋白在各个器官的分布情况，评价复合材料蛋白的缓释情况及体内代谢分布情况。
1.5 主要观察指标 重组人BMP-2/骨修复材料的释放、活性及诱导异位成骨的能力。
1.6 统计学分析 采用Image-Pro Plus 6.0软件进行t检验和方差分析。
2 结果 Results
2.1 重组人BMP-2/骨修复材料体外释放实验 使用人BMP-2 ELISA Kit绘制体外释放曲线，见图1。
由图可见，在对照组(天然BMP-2/骨修复材料)中，天然BMP-2在第1天时即出现约60%的总量释放，随后趋于平缓，在第20天时基本释放完全；而重组人BMP-2/骨修复材料则直至第45天时释放浓度均很低，基本没有释放。
2.2 重组人BMP-2/骨修复材料体外活性检测 空白对照组和阴性对照组无碱性磷酸酶活性，而样品组及阳性对照组具有明显碱性磷酸酶活性，且样品组的碱性磷酸酶活性随着重组人BMP-2剂量的升高而升高，显示出剂量依赖效应，见图2。
2.3 重组人BMP-2/骨修复材料在大鼠体内的异位诱导成骨情况 A组-D组随着暴露剂量的增加，碱性磷酸酶含量亦明显增加，组间两两比较差异有显著性意义 (P 均< 0.05)。E组注射部位肌肉组织内碱性磷酸酶活性也有所升高，第2周时，与其余4组相比差异有显著性意义(P < 0.05)；第4周时，与A组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，但低于B组、C组、D组(P < 0.01)，见图3。
A组和E组中央区和周边区未见明显新生骨，随着暴露剂量的增加，植入材料内可见大量新生骨组织形成，其骨陷窝内骨细胞明显、骨小梁的表面见成骨细胞，骨髓腔明显(C组、D组表现尤为明显)，呈现出剂量依赖性关系，说明重组人BMP-2/骨修复材料具有明显的异位诱导成骨活性且具有一定的剂量依赖性，见图4。
病理软件统计结果表明，暴露的B组、C组、D组新生骨/总组织面积比值呈剂量依赖性增强，组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)，中央区和周边区无显著差异(P > 0.05)，E组未见明显骨细胞分化，见图5，说明与重组人BMP-2特异性结合的骨修复材料对重组人BMP-2的诱导成骨活性具有延长及放大作用。
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刘启省，等. 重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料的制备与性能
天然骨形态发生蛋白2/骨修复材料
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 0.25 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 时间(d)
碱性磷酸酶活性(U/mL) 重组骨形态发生蛋白2/骨修复材料 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
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累积释放率(%) 重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料 重组人骨形态发生蛋白2原液
0.25 μg 0.5 μg 1 μg
重组人骨形态发生蛋白量
1 不同材料中骨形态发生蛋白2的释放曲线 图
Figure 1 The releasing curve of recombinant human bone
morphogenetic protein-2 from different materials
图2 各组C2C12细胞的碱性磷酸酶含量
Figure 2 The alkaline phosphatase activity in C2C12 cell lines of each group
0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0
16 14 组织碱性磷酸酶含量(U/g) 12 10 8 6 4 2 0
A组 B组 C组 D组 E组
新生骨/总组织面积比值 术后2周 术周4周 中央区 周边区 A组 B组 C组 D组 E组 图3 各组植入组织中碱性磷酸酶含量
Figure 3 The alkaline phosphatase activity in the implanted tissues of each group
图注：A-D组植入重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料，其对应重
组人骨形态发生蛋白2的剂量分别为0，2，5，10 μg/块；E组为肌肉注射5 μg 骨形态发生蛋白2原液，两侧注射，每侧注射5 μg。
图5 各组异位成骨统计学分析
Figure 5 Statistical analysis of the ectopic bone formation in each group
图注：A-D组植入重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料，其对应重组人骨形态发生蛋白2的剂量分别为0，2，5，10 μg/块；E组为肌肉注射5 μg 骨形态发生蛋白2原液，两侧注射，每侧注射5 μg。
4 各组植入区骨组织学分析(苏木精-伊红染色，×100) 图
Figure 4 Histological analysis of the implanted tissues in each group (hematoxylin-eosin staining, ×100)
图注：图中A为A组，未见明显新生骨；B为B组；C为C组埋植周边区新生骨；D为C组埋植中央区新生骨；E为D组埋植周边区新生骨；F为D组埋植中央区新生骨；G为E组，未见明显新生骨。A-D组植入重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料，其对应重组人
骨形态发生蛋白2的剂量分别为0，2，5，10μg/块；E组为肌肉注射5μg 骨形态发生蛋白2原液，两侧注射，每侧注射5 μg。
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重组人骨形态发生蛋白2 骨修复材料的制备与性能剖析
