Green 染料释放出来， 荧光急剧减少。 3、在聚合延伸
过程中， 引物退火并形成 PCR 产物。4、聚合完成后， SYBR Green 染料与双链产物结合，定量 PCR 系统检测到荧光的 净增量加大。
荧光染料检测法一般主要是利用荧光染料 （如SYBR Green I）与双链DN分子结合 发光的特性来指示扩增产物的增加， 优点是： 无需另外设计荧光探针， 无需特别 优化条件，简便易行，成本较低，能适用于任何一款定量
PC仪。荧光染料法实
质上是常规的PC反应中添加了荧光染料，借助染料和双链DNA勺结合所发出的荧 光实时监控反应的进程。 由于不需要设计序列特异性探针和优化反应条件， 价格 低廉，通用性强，而且荧光染料法可用于任何一种型号的定量
PCF仪，因而同样
得到广泛采用。在PC反应体系中，加入过量SYBR Green I荧光染料，SYB荧光 染料掺入DNA双链后荧光信号显著增强；当DNA变性时SYBRSreen I染料释放出来， 荧光急剧减少；随后在聚合延伸过程中引物退火并形成 PC产物，SYBR Green染
料与双链产物结合，经检测获得荧光的净增量。荧光信号的增加与
PC产物的增
加完全同步。荧光染料可以在反应末尾对扩增产物进行溶解， 称为溶解曲线分析。 在溶解曲线分析过程中，随着温度从低于产物溶解点缓慢升到高于产物溶解点， 定量PC仪连续监测每个样品的荧光值。基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产 物会在不同的温度点解链 。随着产物的解链就可以看到荧光值的降低并被仪器所 测
量。对溶解曲线进行微分可以计算出溶解峰。 溶解峰可以反映反应中扩增到的 产物，因此用溶解曲线数据就可以进行定量检测了
将强毒株H2的RNA模板做10倍倍比稀释后，用紫外分光光度计测定其浓度， 然后按下面的公式转换成模板的拷贝数：拷贝数 =ND模板浓度X阿氏常数/ （一 个碱基的平均分子量X ND模板的总长度）其中，阿氏常数为6.02 X 1023, 一个碱 基的平均分子量为324.5 , NDV模板的总长度为15 186 bp,标准品的RNA模板分别 进行101 、102 、103 、104、105、106、107稀释后，用紫外分光光度计测 定病
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毒RNA模板的OD6,分别计算其浓度，用于制作标准曲线，同时做一个阴性 对照。
荧光定量PCR的原理及使用
