qPCR效率测定实验方案
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QPCR条件优化
QPCR 条件的优化对于制定稳健的检测方案非常重要。优化不佳的表现是重复样本之间缺乏再现性，以及检测低效且不灵敏。两种主要优化方法是优化引物浓度和/或退火温度。
优化了测定后，重要的是验证反应效率。在报告和比较测定方案时，此处信息非常重要。在本文的实验方案示例中，比较了在广泛和狭窄的cDNA浓度动态范围上的测定效率。在实践中，通常根据样品的预期目标范围来选择一个单个测试范围，因此可以根据实验要求调整给定的实验方案。在本文的示例中，使用10倍和2倍连续稀释液计算效率。标准曲线应包含目标基因的预期表达范围。注意，使用ReadyScriptt?RT试剂盒时，cDNA产量与RNA输入的比例是线性的，因此如果使用RT-qPCR系统的话，可通过下列操作将本文的实验方案改编成适用于那个系统的：1）稀释RNA，并运行RT反应；2）然后在每个得到的cDNA样品上运行qPCR（相关示例请参见）。 然而，情况并非总是如此，并不适用于所有逆转录试剂盒或实验方案。在将此实验方案改编用于替代试剂盒之前，应进行验证。
设备
? ?
定量PCR仪器
PCR设置的层流罩（选购件）
试剂
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用作标准曲线模板（例如cDNA、gDNA或合成模板）的DNA
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KiCqStart SYBR?Green ReadyMix? (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03—取决于仪器，参见 表 P4-6)。
?
PCR级水：PCR级水（W1754或W4502），20mL等分试样；冻存；每次反应均使用新鲜的等分试样。
用于测试基因的正向和反向引物（10 μM储备）。
?
?
热启动预混液 (Taq，Buffer，dNTPs，参考燃料，MgCl2) KiCqStart? SYBR? Green qPCR
ReadyMix? （货号KCQS00）
KiCqStart? SYBR? Green qPCR
ReadyMix? Low Rox (货号KCQS01）
KiCqStart? SYBR? Green qPCR
ReadyMix? 带ROX （货号KCQS02）
KiCqStart? SYBR? Green qPCR
ReadyMix? 用于 iQ （货号KCQS03）
兼容仪器： 兼容仪器： 兼容仪器： 兼容仪器：
Bio-Rad CFX384?
Applied Biosystems 7500 Applied Biosystems 5700
Bio-Rad iCycler iQ?
Bio-Rad CFX96?
Applied Biosystems 7500 Applied Biosystems 7000
Bio-Rad iQ?5
?
Fast Applied Biosystems ViiA 7
Applied Biosystems 7300
Bio-Rad
MiniOpticon? Bio-Rad MyiQ?
Bio-Rad MyiQ? Stratagene Mx3000P?
Applied Biosystems 7700
Bio-Rad/MJ Chromo4? Stratagene Mx3005P?
Applied Biosystems 7900
Bio-Rad/MJ Opticon 2 Stratagene Mx4000?
Applied Biosystems 7900 HT Fast
Bio-Rad/MJ Opticon?
Applied Biosystems 7900HT
Cepheid
SmartCycler?
Applied Biosystems StepOnePlus?
Eppendorf Mastercycler? ep realplex
Applied Biosystems StepOne?
Eppendorf Mastercycler? ep realplex2 s
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Illumina Eco qPCR
Qiagen/Corbett Rotor-Gene? 3000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene? 6000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene? Q
Roche
LightCycler? 480
表 P17-42.SYBR? Green PCR Mix?选择指南
耗材
? ? ?
无菌过滤器移液管吸头
无菌 1.5 mL 螺旋盖微量离心管 (CLS430909) PCR管和PCR板，选择一种以匹配所需格式： ? 单个独立的薄壁200μLPCR管（Z374873或P3114） ? 孔板
- 96孔板 (Z374903) - 384孔板 (Z374911) ? 孔板密封
- ThermalSeal RTS? 封膜 (Z734438) - ThermalSeal RT2RR? 封膜 (Z722553)
本方案注意事项
?
使用随机引发或oligo-dT方法生成cDNA（参见标准逆转录实验方案（两步法））。稀释RT产物以制备标准曲线（作为示例给出1:2和1:10）。也可以稀释RNA，而且可以使用ReadyScript? 试剂盒从每个稀释液中合成cDNA，或者通过稀释RNA，采用逆转录实验方案（一步SYBR? Green I 染料检测）和逆转录实验方案（一步探针检测）中的一步RT-qPCR法。另外，可以替换DNA模板，使得预期的Cq范围在Cq15至Cq38内。
?
对连续稀释液的每个浓度都重复进行反应。
方法
1. 按表P16-40制备足以进行40次反应的qPCR预混液。只进行32次反应，额外 的液体作为移液出错时备用（表P16-41）。 每次 试剂 单次20 μL反应的体积 (μL) 40次 反应的体积（μL） 2× KiCqStart? SYBR? Green qPCR
ReadyMix?
10 400
正向引物 (10 μM) 0.9 36
反向引物 (10 μM) 0.9 36
PCR级纯水
3.2
128
表P16-40.用于生成1:2和1:10标准曲线的反应预混液。
2. 2. 对DNA进行一系列1:10和1:2稀释，每个系列覆盖7个稀释点（见表P16-41，DNA稀释板布局）。
3. 向已标识好的孔中加入5 μL的适当的模板稀释液（参见表P16-41，DNA稀释板布局）。 DNA稀释板布局 板 的列号
1
2
3
4
板的其余部分
A 1 1 1 1
B 0.1 0.1 0.5 0.5
C 0.01 0.01 0.25 0.25
D 0.001 0.001 0.125 0.125
E 0.0001 0.0001 0.0625 0.0625
F 0.00001 0.00001 0.03125 0.03125
G
0.000001
0.000001
0.015625
0.015625
H NTC NTC NTC NTC
表P16-41.96孔板布局的前四列示意图，显示了标准曲线模板稀释的位置。所述稀释是相对于原始原液而言的。当使用人工模板时，可以计算拷贝数（相对于OD读数）。
4. 每孔加入15 μL预混液（见表P16-41）。
5. 给试管盖上盖子，或密封好板子，并贴上标签。（确保标签不会遮挡仪器的激发/检测 光路。）
6. 根据以下两步方案操作样品。重复执行第1-2步40次。接着 用标准解离曲线分析进行扩增。 循环条件 温度 (°C) 时间（秒） 初始变性 / 热启动 95 30
步骤1-2重复40个循环
第1步 95 5
第2步
表P16-42.生成标准曲线的 PCR 循环条件。
60 30
说明：使用标准解离曲线实验方案（数据收集）。 材料
货号 产品描述
CLS430909康宁公司?带螺旋盖微量离心管1.5 mL microcentrifuge tube, polypropylene, w/ attached screw cap, w/ 0-ring, sterile, natural, 500/cs
KCQS02KiCqStart? SYBR? Green qPCR ReadyMix?with ROX? for ABI instruments
KiCqStart? SYBR? Green qPCR ReadyMix?Low ROX?, for ABI and Stratagene instruments
KiCqStart? SYBR? Green qPCR ReadyMix?For Bio-Rad, Cepheid, Eppendorf, Illumina, Corbett, and Roche systems
KCQS01
KCQS00
KCQS03KiCqStart? SYBR? Green qPCR ReadyMix?iQ?, with fluorescein for Bio-Rad systems 带盖PCR微管capacity 0.2 mL
Z374873Z374903PCR 多孔板96 well plate for PCR
PCR 多孔板384 well PCR plate, polypropylene, skirted, non-sterile, 50/cs
Z374911
Z722553ThermalSeal RT2RR? filmnon-sterile, sealing films for real-time qPCR
Z734438ThermalSeal RTS ? 封口膜for qPCR, storage & crystallization, non-sterile
水Nuclease-Free Water, for Molecular Biology
W4502
W1754
水PCR Reagent
qPCR效率测定实验方案
