HPLC法分析不同产地生何首乌中的蒽醌类化合物
摘要】目的：采用反相高效液相色谱法测定十个已知产地的生首乌水解前、后蒽醌类成分的含量，从而评价不同采集地生何首乌的质量。方法：HPLC法，以C18为色谱柱，甲醇-0.1%磷酸（85：15）为流动相，流速为1.0ml?min-1；检测波长254nm；结果：四川峨眉山样品中的蒽醌类成分含量最高，游离型和结合型大黄素含量分别为235.59mg/100g，18.17mg/100g，游离型大黄素甲醚为97.69 mg/100g；而重庆缙云山、贵州施秉、广西田阳样品中蒽醌类成分含量则较低。结论：各产地生何首乌中蒽醌类成分主要为大黄素，大黄素甲醚，其含量随产地差异较大，为生何首乌质量评价提供了可靠的指标和方法。 【关键词】何首乌 蒽醌 HPLC法
【中图分类号】R284【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）36-0131-03
Determination of anthraquinoid compounds in polygonum multiflorum produced in different areas by HPLC
Wenjia,Pan*;Shuang, Lin; Wenmin, Li; Jiantao, Lin Guangdong medical college,dongguan, 523808 *:corresponding author
【Abstract】Objective: To determine the contents of anthraquinone before and after hydrolysis in the commercial medicinal materials of Radix Polygomi Multiflori collected from different areas respectively by RP-HPLC. Methods: The determination was carried out using C18 column，with mobile phase consisted of methanol-0.1% phosphoric acid solution(85:15),the detection wavelength was 254 nm. Results: Anthraquinone contents in Sichuan Emei Mountain sample is maximal.The free type and union type emodin contents were 235.59mg/100g，18.17mg/100g and the free type physcion was 97.69 mg/100g .The contents in the Chongqing Jin Yun county , Guizhou Shi Bing county, Guangxi Tian Yang sample were lower.Conclusion: Anthraquinone contained in the samples were mainly emodin and physcion.The contents varied greatly in the samples from the different producing areas. Make a Radix Polygomi Multiflori quality evaluation has provided the reliable index and method.
【Key words】polygonum multiflorum anthraquinone HPLC
何首乌始载于《开宝本草》，为蓼科植物何首乌Po&gonum mul tiflorum Thunb.的干燥块根。该植物为多年生缠绕性草本，块根多呈纺锤形，表面红棕色至暗褐色，断面紫红色，故又称为赤首乌[1]。其性微温，味苦、甘、涩。主要含有蒽醌类、二苯乙烯苷类和磷脂类等化学成分[2]。生首乌能解毒、消痈、润肠通便，治瘰疡疮痈、风疹瘙痒、肠燥便秘[3]。临床主要用于调血脂、强心、抗菌、抗癌、提高免疫功能等作用[4]。
何首乌的种植分布广泛,主产于河南、湖北、广西、广东、贵州、四川、江西等地[5]。不同产地的气候、湿度、温度、土壤成分、栽培技术等条件各异，再加上采收时间的不同，造成各产地的何首乌的化学成分在种类、含量上有所差异。并且由于野生资源紧缺，人工栽培品日益增多，对不同产地何首乌的质量评价已引起广泛重视。因此，研究和选择其活性成分，并建立可行的检测方法，对有效地控制何首乌质量至关重要。
HPLC在中草药和中成药的成分分析中应用极其广泛。利用反相高效液相色谱
发法分析蒽醌成分，目前主要是对游离蒽醌类大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素甲醚等进行定性及定量测定[6]。蒽醌类化合物为何首乌中的主要成分，可用于评价何首乌的内在质量[7]。蒽醌类成分以游离态及结合蒽醌形式存在于药材中，一般采用乙醇或甲醇等作为溶剂提取[8]。本文以蒽醌为指标成分，采用HPLC法测定不同产地水解前后的生何首乌中蒽醌苷元的含量，从而测定样品中游离及结合型蒽醌类成分的含量，以此考察了产地的何首乌药材的质量。 1 仪器、试剂和试样 1.1 药品与试剂
10种不同产地何首乌样品由广东药学院中药学院药植与鉴定教研室提供，来源见表1，蒽醌衍生物对照品(大黄素110796-200311、大黄酸110757-200206、大黄酚110756-200110、大黄素甲醚110758-200307)均购自中国药品生物制品检定所。
甲醇（天津市广成化学试剂有限公司）、硫酸（广州市东红化工厂）、三氯甲烷（广州化学试剂厂）为分析纯，流动相的甲醇（天津市四友精细化学品有限公司）、磷酸（天津市广成化学试剂有限公司）为色谱纯，水为双蒸水。 1.2 仪器
LC-10ATvp高效液相色谱仪（岛津），SPD-10ATvp紫外-可见检测器（岛津），HW-2000色谱工作站，DL-360A超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)，HH-6数显电子恒温水浴锅（江苏金坛市宏华仪器厂）。 表1 十批生何首乌样品来源
样品编号 样品来源 采集时间 品种 1 德庆 广东德庆官圩金林 2004.6 栽培
2 济源 河南济源承留镇卫福安村 2004.7 野生 3 井冈山 江西井冈山行州 2004.8 野生 4 嵩山 河南登封嵩山法王寺 2004.7 野生 5 靖西 广西靖西小洲开发区 2004.9 栽培 6 峨眉山 四川峨眉山 2004.7 野生 7 缙云山 重庆缙云山 2004.7 野生
8 恩施 湖北恩施七里坪石灰窑 2004.7 野生 9 施秉 贵州施秉县牛大场镇山口 2004.6 栽培 10 田阳 广西田阳坡洪镇 2004.10 野生 2 方法与结果 2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液的制备
精密称取大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品0.0038g、0.0040g、0.0039g、0.0030g，置50mL锥形瓶中，加甲醇适量，超声3min使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1mL分别含0.076mg、0.080mg、0.078mg、0.060mg的大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的混合对照品溶液。 2.1.2 供试品溶液的制备
取生何首乌细粉（过四号筛）1g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称重（准确至0.001g），超声30min ，取出，放冷，称重，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液用0.45μm滤头滤过，即得游离型蒽醌的供试品溶液。
精密吸取上述续滤液10mL,置锥形瓶中,挥干甲醇，加入2.5mol?L-1硫酸溶液
20mL，超声处理5min，加入三氯甲烷20mL，于沸水浴中回流1h，取出，冷却，移置分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸水液层继续加入三氯甲烷振摇提取3次，每次15mL，合并三氯甲烷层，置蒸发皿，回收三氯甲烷，残渣精密加入甲醇定容至10mL，摇匀，用0.45μm滤头滤过，滤液总蒽醌的供试品溶液。 2.2 色谱条件
色谱柱为DiamonsilTMC18（5μm，250mm×4.6mm），流动相为甲醇-0.1%磷酸（85：15），流速为1.0 mL?min-1，检测波长254nm。进样量20μL。四个组分的理论板数与分离度均符合要求。混合对照品和样品的色谱图见图1。
图1 何首乌高效液相色谱图
A.对照品 B.何首乌样品（9号贵州施秉）水解前 C.何首乌样品（9号贵州施秉）水解后
1.大黄酸； 2.大黄素； 3. 大黄酚； 4.大黄素甲醚 2.3 含量测定
2.3.1 线性关系考察
精密吸取混合对照品溶液2、6、8、10、16、20L进样，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程见表2。
表2 线性关系测定结果（n=6）
2.3.2 精密度试验
取混合对照品溶液，连续重复进样6次，大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积积分相对标准偏差（RSD）分别为1.7%，1.2%，1.5%，1.5%。 2.3.3 重复性试验
取8号湖北恩施生何首乌样品粉末（过四号筛）6份，按照2.1.2项下的供试品溶液制备方法制备，依法测定，结果水解前的游离型大黄素、大黄素甲醚含量精密度（RSD）分别为1.2%，1.3%（n=6）；水解后的总大黄素、大黄素甲醚含量精密度（RSD）分别为1.7%，1.4%（n=6）。该样品中大黄酸、大黄酚的含量很低，未能测出。
2.3.4 回收率试验
取已知水解前游离型蒽醌及水解后总蒽醌含量的8号湖北恩施样品0.5g，精密称定，精密加入混合对照品溶液10mL，按照2.1.2项下供试品溶液制备方法制备水解前的游离型蒽醌及水解后总蒽醌的测定用溶液，依法测定，计算，四个成分的平均回收率结果见表3。
表3 回收率测定结果（n=3, %）
2.4 样品测定
取10种不同产地采集的生何首乌样品照2.1.2项下的方法制备供试品溶液，依法测定，记录峰面积，计算样品中大黄素、大黄素甲醚的含量。结果见表4。 表4 样品测定结果
注:★结合蒽醌含量=水解后的总蒽醌含量-水解前的游离型蒽醌含量 3 讨论
3.1 实验结果显示，何首乌中蒽醌类成分以大黄素、大黄素甲醚含量较高，大黄酸、大黄酚含量则较低，游离型蒽醌与结合型蒽醌含量比例也随产地而发生
变化，但之间没有明确的规律，与文献报道[9]的何首乌蒽醌测定结果一致。 3.2 从测定结果看出，四川峨眉山样品中蒽醌类成分含量最高，而重庆缙云山、贵州施秉、广西田阳样品含量则较低。不同产地的何首乌中蒽醌类成分含量相差较大，这提示了,何首乌化学成分的差异主要源于种质差异[10],也可能是与各地气候、土壤等环境条件和栽培条件的不同对其的影响，也有可能是采集时间的不同而造成的差异。
3.3 在不同产地的样品中，从广西田阳采集的何首乌的蒽醌类含量很低，其成分与其他样品的有较大差异，其中广西田阳的10号样品经广西中医学院刘寿养教授鉴定为何首乌的变种棱枝何首乌，故除产地和采集时间因素外，药材的地方习用品使用，也是导致何首乌质量参差不齐的原因，因此建立专属的含量测定指标，对保证品种的品质和质量是非常必要的。
3.4 本文研究的样品产地明确，测定平行，结果具有可比性。研究结果可用于正确认识和评价不同产地生何首乌药材质量，对选取和建立何首乌地道产区具有指导意义。 参考文献
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HPLC法分析不同产地生何首乌中的蒽醌类化合物
