在许多植物物种中研究表明花青素的积累与参与早期花青素生物合成的酶的表达和活性高度相关，例如查尔酮合酶（CHS），查尔酮异构酶（CHI），黄烷酮3-羟化酶（F3H），类黄酮3 0-羟化酶（F30H），包括在其后期生物合成中二氢黄酮醇4-还原酶（DFR），花青素合酶（ANS）和类黄酮3-O-糖基转移酶（UF3GT）。
已知花青素的生物合成基因受保守的MYB-bHLH-WD40 / WDR（MBW）转录因子复合物的协调调控。在苹果中，花青素的生物合成途径受等位基因MYB基因MdMYB1，MdMYB10和MdMYBA的控制。功能测定表明，这些TF通过与花青素生物合成基因的启动子直接结合，以及与bHLH3和WD40蛋白的相互作用，促进花青素的积累和果实着色。例如：bHLH转录因子MdbHLH3与转录因子MdMYB1结合，同时结合花色苷生物合成基因MdDFR和MdUFGT的启动子以激活其表达，从而间接诱导花色苷的产生和苹果果实在低温下着色。
miRNA与花色苷的生物合成有关。在拟南芥中，增加的miR156活性促进了花色苷的积累，而降低的miR156活性则指导了黄酮醇的合成。 miR156靶标SQUAMOSA PROMOTERBINDING PROTEINBINIKE-like 9（SPL9），被证明可通过干扰MYB-bHLH -WD40转录激活复合物来阻止花青素生物合成基因的表达，从而抑制花青素的积累 。
LncRNA的序列保守性低于编码蛋白质的mRNA，并且具有器官、发育和环境表达特异性。现在已知LncRNA在多种生物学过程中起着重要的作用，目前已在植物中鉴定出多种LncRNA及其分子功能，它们以顺式和反式方式协调基因表达。但是迄今为止，LncRNA是否与花青素的生物合成相关还未有研究。在这项研究中，我们进行了高通量RNA序列实验，以研究它们在暴露于光下后在苹果果实中花色苷积累中的潜在作用。 研究路线：
研究结果：
1、 LncRNA的鉴定以及差异分析-LncRNA测序：3个时间点差异表达85个LncRNA
成熟的“红富士”水果用双层的不透光纸袋装袋，开花后140天收获。将收获的苹果在低光照下从其包装袋中转移到培养箱中进行光照处理。连续光照处理3天后，苹果皮显示出花青素积累的迹象，处理8天后果实完全变红（图1上）。将12个苹果皮（开始光照处理后的0、3、5和8天）进行了LncRNA测序，共鉴定到编码38 025个蛋白的mRNA和5297个lncRNA的转录本。
对鉴定到的LncRNA和mRNA进行差异分析，在0天与3天的差异基因数目多（图1下左），在三个光处理时间点（图1下左）共有3041个差异基因，在三个时间点（图1下右）之间差异表达85个LncRNA。对差异基因进行KEGG途径富集分析表明，差异基因主要富集在“苯丙烷类生物合成”和“类黄酮生物合成”两条通路上，这一结果与观察到的表型变异相符。同时预测差异表达DE-LncRNA潜在的顺式和反式靶标可鉴定出1407个mRNA。进一步分析表明，在三个时间点共同差异表达108个mRNA。
图1 上图：去袋光照处理不同时间苹果颜色变化的表型；下图 左：韦恩图展示不同组差异mRNA的数目
情况；下图 右：维恩图展示不同组差异LncRNA的数目情况
2、 共表达网络构建-WGCNA分析：SPL2-like和SPL33是两个候选转录因子
对样品中检测到的mRNA进行WGCNA分析，结果主要分成7个模块（图2a）；同时对样品中的花青素物质进行HPLC分析，结果表明矢车菊素是随着光照时间变化增加明显的花青素（图2b）；将WGCNA分析得到的模块与花青素进行相关性分析，结果表明ME pink和ME blue两个模块的基因与花青素的积累强烈正相关，在这两个模块中的差异基因主要是转录因子，包括MYB, bHLH, SPL, WRKY , ERF家族。其中SPL家族中影响多个拟南芥的发育阶段，SPL2-like和SPL33与ME pink和ME blue两个模块相关。qRT-PCR表明随着光照时间加长，这两个基因的表达量也逐渐增加（图2c）。
图2 a.WGCNA模块与代谢物相关性分析，红色代表正相关，蓝色代表负相关，横坐标代表代谢物，纵坐标代表不同的模块；b.不同样品中不同种类花青素含量测定直方图，横坐标代表不同种类的花青素，纵坐标代表含量，不同颜色代表不同的处理时间；c.转录因子SPL2-like、SPL33在不同样品中的表达量
3、 筛选核心LncRNA-构建eTM网络：miR156a，MLNC3.2，MLNC4.6，SPL2-like和SPL33
之间存在关系
构建miRNA-lncRNA-mRNA网络筛选核心的LncRNA，结果表明两个DE LncRNA，分别称为MLNC3.2（MSTRG.123423.2）和MLNC4.6（MSTRG.137274.6）可能是miRNA156a的潜在靶标，并且SPL2 like和SPL33可能也是miR156a的靶标（图3）。在3到8天的时间间隔内进行相关分析，结果显示miR156a转录本丰度的模式与其推定的靶基因SPL2-like（R2 = 0.978）和SPL33（R2 = 0.9319）的表达呈负相关，并且miR156a表达与MLNC3.2（R2 = 0.9813）和MLNC4.6（R2 = 0.9954）相关。这些结果表明miR156a，MLNC3.2，MLNC4.6，SPL2-like和SPL33之间存在关系。
图3 相关性网络图 红色圆圈代表上调表达mRNA，红色正五边形代表上调表达miRNA，绿色正方形
下调表LncRNA，绿色圆圈代表下调表达mRNA
4、功能验证-超标达及RNAi实验：LncRNA MLNC3.2、MLNC4.6是miR156a的竞争性内源
基因
为了研究两个预测的eTM是否具有消除miR156a及其靶标之间的结合并参与光诱导的花色苷生物合成的作用，构建超表达载体以及沉默载体。miR156a的过表达会抑制MLNC3.2、MLNC4.6、SPL2-like和SPL33的表达，注射部位呈黄色或浅绿色；而miR156a沉默则促进了SPL2 like、SPL33、MLNC 3.2和MLNC4.6的表达，导致果皮红色显著（图4a）。使用qRT-PCR，当过表达SPL2 like、SPL33、MLNC3.2和MLNC4.6或miR156a沉默时，我们发现MdCHS、MdDFR和MdUFGT的表达显著增加。在过表达miR156a的果皮中，与对照果皮相比，MdCHS，MdDFR和MdUFGT的表达大大降低，并且在SPL2-like、SPL33、MLNC3.2和MLNC4.6沉默的果皮中观察到相似的结果（图4b）。
为解析这两种LncRNA的功能，我们在苹果果实中超标达35S :: mMLNC3.2，35S :: mMLNC4.6（mMLNC3.2和mMLNC4.6代表miR156a靶向基序中的突变）未见明显的表型变化。与野生型对照相比，过表达SPL2，SPL33，MLNC3.2和MLNC4.6的苹果愈伤组织中花色苷的积累水平更高，在过表达miR156a，mMLNC3.2和mMLNC4.6的愈伤组织中未观察到色素积累。使用酵母双杂交和双分子荧光互补（BiFC）分析来表征SPL转录因子与花色苷积累的关系，我们观察到SPL2 like和SPL33蛋白与MdMYB1相互作用，MdMYB1是苹果花色苷生物合成中的关键调控基因。
花青素+LncRNA解析苹果响应光诱导积累花青素的机制
